ING - Scuola di Ingegneria Industriale e dell'Informazione
3-ott-2018
2017/2018
SOMMARIO
INTRODUZIONE
La terapia genica è considerata una delle strategie più promettenti per la prevenzione e il trattamento delle malattie genetiche. L'introduzione di materiale genetico esogeno nelle cellule consente di sintetizzare nuove proteine, inserire, sostituire o silenziare geni specifici [1].
Questa tesi si concentra sul silenziamento di specifici geni, ottenuto sfruttando il meccanismo dell’RNA ad interferenza (RNAi), basato sull’utilizzo di siRNA ovvero corte sequenze di RNA a doppio filamento composte da 21-23 nucleotidi (bp). Una volta che le molecole di siRNA entrano nella cellula sono integrate nel complesso RISC (RNA-Induced-Silencing-Complex), il che causa la divisione del doppio filamento di siRNA nel filamento guida che si associa al complesso RISC e nel filamento anti-parallelo che viene degradato. Il filamento guida associato al complesso RISC si lega alla sequenza complementare di mRNA (messenger-RNA), prevenendone la traduzione in proteina [2] (Figura 1).
Figura1: Meccanismo dell’RNAi basato su molecole di siRNA
Ci sono due tecniche principali [3] per favorire l’internalizzazione di acidi nucleici nelle cellule, che sono i metodi fisici [4] e vettori. Questa tesi si concentra sull’uso di vettori non-virali [6]. I vettori non-virali [1], [3] sono molecole cationiche sintetiche di natura lipidica o polimerica in grado di auto-assemblarsi con gli acidi nucleici grazie a interazioni di natura elettrostatica, formando particelle chiamate complessi. I complessi sono chiamati rispettivamente lipoplessi e poliplessi. Tra I polimeri cationici quello maggiormente utilizzato è il PEI (Poli-Etilen-Immina) [1] [7].
Il PEI è il vettore utilizzato in questo lavoro di tesi ed è caratterizzato da un'elevata buffering capacity [8], definita come la sua capacità di variare il grado di protonazione, fondamentale per l'internalizzazione e il rilascio di acidi nucleici all'interno della cellula, e un'eccellente efficienza di trasfezione sia per PEI lineare (lPEI) che per PEI ramificato (bPEI).
L'efficienza di trasfezione del vettore PEI dipende dal peso molecolare, dal rapporto N/P (rapporto amina-fosfato), dalla dose di acido nucleico, dal buffer di complessazione e dal terreno di coltura cellulare [7].
A supporto dell'approccio sperimentale, le simulazioni di dinamica molecolare (MD) possono essere eseguite su sistemi costituiti da molecole di siRNA e PEI. In letteratura non ci sono molti esempi di studi in cui esiste un approccio sperimentale e computazionale parallelo [9] [10].
I principali vantaggi nell'uso delle simulazioni MD sono: la riproducibilità dei processi, il risparmio delle risorse di laboratorio e l'indagine sulla scala atomistica, mentre gli svantaggi sono legati ai tempi di simulazione e alle approssimazioni introdotte.
I modelli che possono essere utilizzati sono: i) Modelli di All-Atoms (AA), modelli estremamente precisi e dettagliati in cui una particella corrisponde a un atomo; richiedono lunghi tempi di simulazione; ii) Modelli Coarse-Grained (CG), in cui una particella rappresenta un gruppo di atomi, caratterizzato da un livello inferiore di dettaglio ma da una maggiore velocità di simulazione rispetto ai modelli AA [11].
Oltre al modello adottato, vi sono due modi per simulare l'ambiente acquoso: la condizione di solvente esplicito e la condizione di solvente implicito. Nel primo caso le molecole del sistema sono inserite in un ambiente finito riempito con molecole d’acqua e ioni, che consente una simulazione realistica dell'ambiente fisiologico. Nel caso di solvente implicito le molecole vengono inserite in un ambiente infinito privo di molecole d’acqua e ioni e la presenza del solvente viene simulata impostando la costante dielettrica del mezzo su un valore uguale a quello dell'acqua, simulando così la presenza del solvente.
Quasi tutti gli studi computazionali si concentrano su PEI da 2 kDa. L’innovativo parallelismo tra i due approcci, proposto in questo lavoro di tesi prevede che le simulazioni vengano condotte su PEI da 25 kDa in modo da ricreare le caratteristiche delle simulazioni in vitro.
In questo scenario l’approccio combinato usato in questo lavoro combina esperimenti in vitro con simulazioni di dinamica molecolare per uno studio in parallelo degli ottimali parametri chimico-fisici per sia complessazione che trasfezione e valutare se l’approccio computazionale possa essere sfruttato come tool per lo screening di trasfettanti.
MATERIALI E METODI
Come materiali sono stati usati: bPEI e lPEI da 25kda, salmon sperm DNA e 3 sequenze di siRNA (due sequenze anti-GFP e una sequenza scrumble usata come controllo negativo).
Gli esperimenti sono stati condotti su cellule HEK-293-GFP in grado di esprimere la proteina GFP.
Saggio di titolazione. Nella prima parte del lavoro ci si è concentrati sulla caratterizzazione delle molecole di PEI utilizzate, al fine di definirne il grado di protonazione. Sono state eseguite dunque delle curve di titolazione utilizzando NaOH 0.1 M come soluzione titolante, previa acidificazione con HCl 1 M fino a pH 2.0 della soluzione polimerica costituita da 20 mL di PEI e 10mL di dH2O. La concentrazione del polimero puro preso dallo stock è di 0.9 µg/µL per lPEI e 1 µg/µL per bPEI..
Preparazione poliplessi. Sono state prima preparate le soluzioni polimeriche a partire dallo stock a concentrazione di ammine nota (20 mM):
〖[N]〗_finale=3.03(nmol/〖µg〗_(acido nucleico) )* (〖µg〗_(acido nucleico)*N/P)/〖µL〗_(sol polimerica)
V_(pol stock)= (V_(sol pol) * [N]_finale )/[N]_iniziale
V_buffer= V_(sol polimerica )- V_(pol stock)
La concentrazione dello stock di siRNA è di 0.1 µg/µL e la sua concentrazione finale nella soluzione di trasfezione è stata scelta in base alla letteratura di 0.0125 µg/µL.
V_(acido nucleico)= (〖dose〗_(acido nucleico) (µg))/C_stock
V_(soluz trasfez)= (〖dose〗_(acido nucleico ) (µg))/C_(soluz trasfez (fin))
V_(soluz polim)= V_(soluz trasfez)- V_(acido nucleico)
La complessazione prevede l’aggiunta del volume di acido nucleico alla soluzione polimerica. I complessi sono stati incubati per 30 minuti prima di essere somministrati alle cellule.
Caratterizzazione chimico-fisica. La caratterizzazione chimico-fisica ha permesso di valutare l’abilità del PEI di legarsi alle molecule di siRNA, usando il saggio ad esclusione con SYBR Green I e valutando la dimensione e la superficie di carica dei complessi tramite analisi con DLS.
Il saggio di esclusione del SYBR Green I è stato condotto aggiungendo alla soluzione di complessazione, preparata alla dose di siRNA di 0.015 µg per pozzetto di una multiwell-384 nera, 1.2 µL di SYBR Green I 200X diluito 1:1 (v/v) in buffer ed aspettando 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente. Successivamente il volume della soluzione è stato portato a 125 µL con aggiunta di buffer e da ogni soluzione sono stati distribuiti 30 µL per ogni pozzetto della multiwell.
I complessi per l’analisi al DLS sono stati invece preparati con 5 µL di siRNA e 35 µL di soluzione polimerica corrispondente al rapporto N/P desiderato. Dopo 30 minuti di incubazione, per le misure di raggio idrodinamico (DH) il volume finale utilizzato è stato di 500 µL, ottenuti tramite diluizione in buffer (dH2O), a cui sono stati aggiunti ulteriori 200 µL di dH2O per effettuare l’analisi di Z-potential (ζP).
Esperimenti di trasfezione in vitro. Questa fase dello studio ha visto innanzitutto la validazione delle sequenze di siRNA, mediante trasfezione con jetPEI® [12]. Sono state quindi preparate una soluzione di 10 µL contenente 0.25 µg di siRNA diluiti in 150 mM NaCl e una soluzione di jetPEI® di egual volume ottenuta diluendo 0.5 µL di trasfettante in buffer. La soluzione di jetPEI® è stata quindi unita alla soluzione di acido nucleico. È seguito un tempo di incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, a valle del quale i 20 µL di soluzione di trasfezione sono stati somministrati al singolo campione nella piastra multiwell-96.
Per gli esperimenti di trasfezione eseguiti con complessi siRNA/PEI, invece, i complessi sono stati preparati come sopra riportato e le cellule HEK-293-GFP sono state seminate alla densità di 5.0×104 cellule/cm2 in 100 µL di mezzo completo. I complessi sono stati somministrati alle cellule 24 h dopo la semina. Le dosi di siRNA utilizzate sono state: 0.01024 µg/well, 0.25 µg/well e 0.5 µg/well In caso di trasfezione in mezzo senza siero le cellule sono state lasciate per le 4 h successive alla trasfezione in 100 µL di DMEM, dopo le quali il mezzo è stato nuovamente sostituito con mezzo completo.
A valle di tutti gli esperimenti di trasfezione (48 h) sono state condotte le analisi della citotossicità e l’analisi dell’efficienza di trasfezione dei complessi.
La citotossicità è stata valutata tramite saggio Alamar Blue®. Per ogni pozzetto contenente le cellule il mezzo di coltura è stato sostituito con 100 µL di mezzo contenente 10 µL di resazurina. Dopo 4 h di incubazione è stata eseguita l’analisi di fluorescenza con lo spettrofluorimetro, che ha restituito i risultati espressi in RFU. Alla vitalità del non trasfettato (CTRL) è stato assegnato il 100% e la citotossicità è stata determinata come segue:
Vitalità (%)= (〖RFU〗_campione- 〖RFU〗_blank)/(〖RFU〗_(non trasfettato)- 〖RFU〗_blank ) x 100
Citotossicità (%)=100%-Vitalità (%)
L’efficienza di trasfezione è stata valutata come rapporto tra l’abbattimento del segnale di fluorescenza e il quantitativo proteico del campione, misurato mediante saggio BCA. L’efficienza di trasfezione è espressa in RFU*mg-1 di proteine.
Sia per l’analisi in fluorescenza che per la quantificazione proteica si è reso necessario innanzitutto lisare i campioni. La lisi cellulare è avvenuta, dopo aver effettuato il saggio Alamar Blue®, in 110 µL di soluzione di lisi, preparata diluendo il buffer di lisi in rapporto 1:20 in dH2O, in ogni pozzetto della multiwell-96 contenente cellule. I campioni sono stati poi lasciati a -80°C per tutta la notte.
L’analisi in fluorescenza è stata invece effettuata caricando 20 µL di lisato cellulare per ogni pozzetto di interesse in una multiwell da 384 pozzetti nera. I risultati ottenuti sono espressi in RFU.
Il saggio BCA per la quantificazione proteica è effettuato in una multiwell da 96 pozzetti utilizzando le istruzioni del kit (Pierce™ BCA Protein Assay kit Instructions).
Simulazioni di dinamica molecolare. I software utilizzati per la dinamica molecolare sono VMD, utilizzato per l’analisi e la visualizzazione dei sistemi simulati, NAMD, che è il codice di dinamica molecolare, utilizzato in parallelo a VMD per la simulazione dei sistemi, ed infine Materials Studio software usato per la creazione e stabilizzazione delle molecole di PEI.
I modelli molecolari di bPEI e lPEI sono stati creati utilizzando il software Material Studio a partire dalle unità ripetitive dei polimeri utilizzati in laboratorio, ricreando l’esatto grado di protonazione ottenuto dagli esperimenti di titolazione. L’unità ripetitiva è stata realizzata manualmente e successivamente minimizzata. Successivamente sono stati ottenuti i polimeri finali da 25 kDa ripetendo le unità ripetitive create. La creazione del file force-field del polimero è stata fatta, manualmente, a partire dal file di force-field dell’unità ripetitiva ottenuto tramite il programma CHARMM General Force-Field. Sia la sezione di topology che di parameters dei file force-field dei polimeri finali sono state create a partire da quelle dell’unità ripetitiva. Successivamente all’ottenimento dei file di struttura e di carica per le molecole di PEI, le molecole sono state minimizzate dal punto di vista energetico per 2x104 step.
La molecola di siRNA (siRNA GFP-E) è stata creata utilizzando il software Make-na Server in grado di restituire il file di coordinate della sequenza desiderata. Il force-field utilizzato per il siRNA è il force-field standard per acidi nucleici di CHARMM, utilizzato per creare il file di estensione .psf della molecola. In ultimo questa è stata minimizzata per 2x104 step.
Le simulazioni effettuate sono tutte state eseguite in solvente implicito e con condizioni al contorno sferiche in modo da limitare la migrazione eccessiva nello spazio delle molecole. Le simulazioni sono state condotte ai rapporti N/P di complessazione e N/P di trasfezione ottimali, valutati a valle deglie sperimenti.
Infine i parametri analizzati sono stati: RMSD per l’indicazione del raggiungimento della stabilità del sistema, SASA per la valutazione dell’avvenuta complessazione e APBS per l’analisi della carica superficiale del complesso.
RISULTATI E DISCUSSIONE
La determinazione del grado di protonazione delle molecole di PEI ha permesso di ricreare le molecole in modo coerente dal punto di vista computazionale. I risultati trovati sono il 55% delle ammine protonate per bPEI a pH fisiologico (~ 7.4) e il 32.5% delle ammine per lPEI. I risultati trovati per la molecola di bPEI sono coerenti con quelli trovati in letteratura, mentre quelli trovati per la molecola di lPEI non hanno corrispondenza in letteratura [13].
Dai risultati delle curve di complessazione si è concluso che la totale complessazione del siRNA si verifica al rapporto N/P 2 per bPEI e N/P 4 per lPEI; e dall'analisi DLS sono emerse una dimensione maggiore (Figura 2A) e una carica superficiale inferiore (Figura 2B) dei complessi siRNA / lPEI rispetto a quelle siRNA / bPEI.
Figura 2: Risultati dell’analisi al DLS per complessi siRNA/PEI: A) dimensione; B) carica superficiale
Dopo la caratterizzazione chimico-fisica dei complessi, sono stati eseguiti esperimenti di trasfezione per la validazione delle sequenze di siRNA usando jetPEI® come trasfettante. Gli esperimenti condotti hanno portato a: i) l'ottimizzazione della dose di siRNA da utilizzare, ovvero 0,25 μg di siRNA/pozzetto in una piastra multiwell-96; ii) il tipo cellulare che garantirebbe la migliore detection dell’abbattimento del segnale di fluorescenza, cioè HEK-EGFP MOI 0.1; iii) l'ottimizzazione della densità di semina ottimale per esperimenti di trasfezione, cioè 5×104 cellule/cm2.
Dopo la validazione delle sequenze di siRNA, abbiamo eseguito esperimenti di trasfezione usando bPEI e lPEI da 25 kDa. Dall'analisi dei risultati degli esperimenti di trasfezione, eseguita in un range di rapporti N/P 0-80, è emerso che il range di condizioni che massimizza l'efficienza di trasfezione e limita la citotossicità dei complessi è quello di N/P 12-20 , solo per complessi siRNA/bPEI, mentre i complessi siRNA/lPEI si sono dimostrati inefficaci in tutte le condizioni testate. Riscontrati un effetto citotossico e un’efficienza di trasfezione del siRNA "nudo", abbiamo eseguito esperimenti di trasfezione, lasciando le cellule per 4 ore dopo la somministrazione di complessi in mezzo senza siero, al fine di valutare la dipendenza di questi effetti da un'interazione tra il siRNA "nudo" e le proteine del siero.
I risultati dell’esperimento hanno mostrato un annullamento dell’effetto citotossico del siRNA “nudo”, confermando così l'ipotesi della possibile interazione con le proteine del siero; e hanno confermato l'efficacia dei soli complessi preparati con bPEI ad un rapporto N/P di 15 (Figura 3A), invece quelli preparati con lPEI si sono confermati inefficienti (Figura 3B). L'efficienza di trasfezione del bPEI è paragonabile a quella della Lipofectamina, considerata altamente performante [14], [15].
Figura 3: Risultati sull’efficienza di trasfezione in mezzo senza siero: A) siRNA/bPEI; B) siRNA/lPEI
Per quanto riguarda i risultati delle simulazioni, le simulazioni condotte a rapporto N/P 15, non hanno mostrato differenze sui parametri SASA e APBS per i complessi siRNA/bPEI e siRNA/lPEI (Figura 4). Questo è in contrasto con i risultati degli esperimenti (DLS) che mostrano importanti differenze nei parametri di dimensione e carica superficiale, a seconda del PEI utilizzato.
Figura 4: Risultati analisi APBS: A) siRNA/bPEI; B) siRNA/lPEI
CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI
Lo scopo di questo lavoro di tesi era quello di trovare una corrispondenza tra approccio sperimentale e computazionale riguardo i parametri di complessazione e trasfezione, al fine di sviluppare uno strumento per lo screening di trasfettanti.
Gli esperimenti di trasfezione dimostrano che la migliore condizione di trasfezione è il rapporto N/P 15-20 con complessi preparati con bPEI e dose di 0.25 μg siRNA/pozzetto,
Da un punto di vista computazionale, non è stata trovata alcun riferimento in letteratura in cui si simulassero condizioni di complessazione realistiche, in quanto tutti gli studi di letteratura trovati, vengono utilizzati PEI con peso molecolare <2 kDa [16], [17]. In questo studio, invece, è stata affrontata l'analisi di sistemi più realistici che simulano la complessazione di PEI, utilizzati anche negli esperimenti di trasfezione, alle condizioni di rapporto N/P identificate come ottimali (rapporto N/P 15). Tuttavia, i risultati delle simulazioni non hanno confermato le differenze dei parametri chimico-fisici, in particolare della carica superficiale, tra complessi a seconda del PEI utilizzato. Ciò sembra portare a considerare le approssimazioni introdotte a livello delle simulazione troppo significative, per poter mantenere il parallelismo con le condizioni sperimentali.
Le semplificazioni introdotte nel sistema per realizzare lo studio sono quindi troppo accentuate, tanto da causare la perdita di differenze significative che dovrebbero essere individuate dai risultati delle simulazioni.
In prospettiva, ulteriori studi mireranno a studiare una possibile dipendenza dei risultati ottenuti nelle simulazioni dalla particolare configurazione iniziale necessariamente imposta sulle molecole del sistema. Sarebbe utile valutare, non solo il fenomeno della complessazione, ma anche quello dell'internalizzazione dei complessi modellando la membrana cellulare e valutando il rilascio di acido nucleico all'interno dell'ambiente intracellulare.
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ABSTRACT
INTRODUCTION
Gene therapy is considered one of the most promising strategies for the prevention and treatment of genetic diseases. The introduction of exogenous genetic material into cells allows to synthesize new proteins, insert, replace or silence specific genes [1].
This thesis focuses on the silencing of specific genes, achieved thanks to the exploitation of the interfering RNA (RNAi) mechanism based on siRNA (small interfering RNA), i.e. short double-stranded RNA sequences composed of 21-23 nucleotides (bp). Once the siRNA molecule enters the cell, it is integrated into the RISC (RNA-Induced-Silencing-Complex) complex, which causes the division of the double-stranded siRNA into its sense strand which binds to the RISC complex and anti-sense strand that is degraded. The sense strand associated with the RISC complex binds to the complementary sequence of mRNA (messenger-RNA), preventing its translation into protein [2] (Figure 1).
Figure 1 Interfering RNA (RNAi) mechanism based on siRNA molecules.
There are two main techniques [3] to facilitate the entry of nucleic acids into the cell, that are physical methods [4] and vectors. This thesis focus on the use of non-viral [6] gene vectors. Non-viral vectors [1] [3] are cationic synthetic molecules of a lipid or polymeric nature able to self-assemble through electrostatic interactions with nucleic acids, forming particles called complexes. The complexes are called respectively lipoplexes / polyplexes. With regard to cationic polymers the most widespread and used is PEI (Polyethylenimine) [1] [7].
The PEI is the vector used in this thesis work and is characterized by a high buffering capacity [8] fundamental for the internalization and release of nucleic acids inside the cell, defined as the ability to vary its degree of protonation, and excellent transfection efficiency both for linear PEI (lPEI) and for branched PEI (bPEI).
The transfection efficiency of the PEI vector is dependent on molecular weight, N/P ratio (amine-to-phosphate ratio), nucleic acid dose, complexation buffer and cell culture medium [7].
In support of the experimental approach, molecular dynamics (MD) simulations can be performed on systems made up of siRNA and PEI molecules. In the literature there are not many examples of studies in which there is a parallel experimental and computational approach [9] [10].
The main advantages in the use of MD simulations are: the reproducibility of the processes, the saving of laboratory resources and the investigation on the atomistic scale, while the disadvantages are related to the simulation times and to the approximations introduced.
The models that can be used are: i) All-Atoms (AA) models, extremely precise and detailed models in which one particle corresponds to one atom; they require long simulation times; ii) Coarse-Grained (CG) models, in which one particle represents a group of atoms, characterized by a lower level of detail but by greater simulation speed than the AA models [11].
Apart from the model adopted, there are two ways of simulating the aqueous environment: the explicit solvent condition and the implicit solvent condition. In the first case the molecules of the system are inserted in a finite-dimensional environment filled with water and ion molecules, which allows realistic simulation of the physiological environment. In the case of an implicit solvent the molecules are inserted in an infinite environment free of water and ion molecules and the presence of the solvent is simulated by setting the dielectric constant of the medium to a value equal to that of water, thus simulating the presence of the solvent.
Almost all the computational works focus on 2 kDa PEIs. The innovative parallelism between the two approaches proposed in this thesis work therefore suggests the simulation of PEI of 25 kDa molecular weight in order to recreate the in vitro transfection characteristics.
In this scenario, the approach used in this thesis project combines in vitro experiments with molecular dynamics simulations for a parallel study of optimal chemical-physical parameters for both complexation and transfection and evaluate the possible use of dynamic simulations as a tool for transfectant screening.
MATERIAL AND METHODS
As for the materials were used: 25 kDa bPEI and lPEI, salmon sperm DNA (s.s.DNA) and three siRNA sequences (two anti-GFP sequences and a scrumble sequence, used as a negative control). The experiments were conducted on HEK-293-GFP cells able to express the GFP protein.
Titration assay. In the first part of the work we focused on the characterization of the PEI molecules, in order to define the degree of protonation. Titration curves were then performed using 0.1 M NaOH as titrant, after acidification with 1 M HCl to pH 2.0 of the polymer solution consisting of 20 mL of PEI and 10 mL of dH2O. The concentration of pure polymer taken from the stock is 0.9 μg/μL for lPEI and 1 μg/μL for bPEI.
Polyplex preparation. Polymer solutions were first prepared starting from the known amine concentration stock [N]initial = 20 mM:
〖[N]〗_final=3.03(nmol/〖µg〗_(nucleic acid) )* (〖µg〗_(nucleic acid)*N/P)/〖µL〗_(polymer sol.)
V_(pol stock)= (V_(polymer sol.) * 〖[N]〗_final )/〖[N]〗_inizial
V_buffer= V_(polymer sol.)- V_(pol stock)
The siRNA stock concentration was 0.1 μg/μL and its final concentration in the transfection solution was chosen based on the literature of 0.0125 μg/μL.
V_(transfection sol.)= (〖dose〗_(nucleic acid ) (µg))/C_(transfection sol.(fin))
V_(polymer sol.)= V_(transfection sol.)- V_(nucleic acid)
The siRNA solution was added to the polymer solution. The complexes are then incubated at room temperature for 20-30 minutes, before being given to the cells.
Physico-chemical characterization of polyplexes. The physico-chemical characterization allowed the evaluation of the ability of the PEI to bind and complex the siRNA molecules, using the SYBR Green I exclusion assay and the evaluation of the size and surface charge of the complexes by analysis with DLS (Dynamic Light Scattering).
The SYBR Green I exclusion assay was conducted by adding to the complexation solution, prepared at the siRNA dose of 0.015 μg per well of a black 384-multiwell plate, 1.2 μL of SYBR Green I 200X diluted 1: 1 (v/v) in buffer and then wait for 10 min of incubation at room temperature. Subsequently, the solution volume was made to 125 μL with buffer addition and 30 μL was distributed per each well of the multiwell-384 from each solution at different N/P ratio.
The complexes for the analysis at the DLS were instead prepared with 5 μL of siRNA and 35 μL of polymer solution corresponding to the desired N/P ratio. After 30 minutes of incubation, for the hydrodynamic radius (DH) measurements the final volume used was 500 μL, obtained by dilution in buffer (dH2O), to which were added an additional 200 μL of dH2O to perform the analysis of Z-potential (ζP).
In vitro transfection experiments. In vitro transfection with jetPEI® as the transfectant were performed to evalutae the effectiveness of siRNA sequences in silencing the GFP [12]. A solution of 10 μL containing 0.25 μg of siRNAs diluted in 150 mM NaCl were prepared and then an equal volume of jetPEI® solution was obtained by diluting 0.5 μL of jetPEI® in buffer. The jetPEI® solution was then combined with the nucleic acid solution. After 30-minute incubation at room temperature, 20 μL of transfection solution was administered to all the sample in the multiwell-96 plate.
For transfection experiments performed with siRNA/PEI complexes, instead, the complexes were prepared as above reported and the HEK-293-GFP cells were seeded at the density of 5.0 × 104 cells/cm2 in 100 μL of complete medium. The complexes were administered to the cells 24 hours after seeding. The siRNA doses used were: 0.01024 μg/well, 0.25 μg/well and 0.5 μg/well. In case of transfection in serum-free medium, the cells were left for 4 h after transfection in 100 μL of DMEM, after which the serum-free medium has been replaced again with cDMEM.
After 48 h from transfection experiments, cytotoxicity analysis and the analysis of the transfection efficiency of the complexes were carried out.
Cytotoxicity was evaluated by Alamar Blue® assay. For each well containing the cells the culture medium was replaced with 100 μL of medium containing 10 μL of resazurin dye. After 4 h of incubation the fluorescence was read by means of the GENios Plus Reader (Tecan, Segrate, Italy) (λex = 540 nm; λem = 595 nm). Viability of untransfected cells (CTRL) was assigned to as 100% and cytotoxicity was determined as follows::
Viability (%)= (〖RFU〗_sample- 〖RFU〗_blank)/(〖RFU〗_CTRL- 〖RFU〗_blank ) x 100
Cytotoxicity (%)=100%-Viability (%)
The transfection efficiency was evaluated as the ratio between the knocking down of the fluorescence signal and the amount of protein in the sample, measured by the BCA assay. Transfection efficiency is expressed in RFU × mg-1 of proteins.
Both for fluorescence analysis and for protein quantification it was first necessary to lyse the cells. The cell lysis, after carrying out the Alamar Blue® assay, was performed with 110 μL of lysis solution, prepared by diluting the lysis buffer in a 1:20 ratio in dH2O, for each well of the multiwell-96 containing cells. The samples were then left at -80 °C, overnight.
Fluorescence analysis was performed by loading 20 μL/well of cell lysate in separate wells a 384-well plate. The results obtained are expressed in RFU.
The BCA assay for protein quantification was performed according to the instructions in the BCA kit manual (Pierce ™ BCA Protein Assay Kit Instructions) in a 96-well plate using 20 µL of cell lysate.
Molecular dynamics simulations. The software used for molecular dynamics are VMD, used for the analysis and visualization of the simulated systems, NAMD, which is the molecular dynamics code used in parallel to VMD for systems simulation, and Materials Studio used for the creation and stabilization of PEI molecules.
The molecular models of bPEI and lPEI were created using the Material Studio software starting from the repeating units of the polymers used in the laboratory and recreating the exact degree of protonation obtained by the titration experiments. The repetitive unit was created manually and subsequently minimized. Then the final polymers of 25 kDa were obtained by repeating the repetitive units created. Both the topology and parameters sections of the force-field files of the final polymers were made, manually, starting from the force-field file of the repeating unit obtained through the CHARMM General Force-Field program. After obtaining the structure (pdb) and charge (psf) files for the PEI molecules, the molecules were minimized for 2x104 step.
The siRNA molecule (siRNA GFP-E.) was created using the Make-na Server software that is able to return the coordinate file of the desired sequence. The force-field used for siRNA is the standard force-field for CHARMM nucleic acids, used to create the molecule's extension file psf. Lastly the siRNA molecule was minimized for 2x104 steps.
The simulations carried out have all been performed in implicit solvent condition and with spherical boundary conditions in order to limit the excessive migration of the molecules. The simulations were conducted to the optimal N/P ratio for both complexation and transfection, evaluated downstream of the experiments.
In the end, the parameters analyzed were: RMSD for the indication of the system stability achievement, SASA for the evaluation of the successful complexation and APBS for the analysis of the surface charge of the complexes.
RESULTS AND DISCUSSION
The determination of the protonation degree of the PEI molecules allowed to recreate the molecules in a coherent way from a computational point of view. The results found are 55% of the protonated amines for bPEI at physiological pH (~ 7.4), and 32.5% of the amines for lPEI. The results found for the bPEI molecule are consistent with those found in literature, while those found for the lPEI molecule have no matching in literature [13].
From the results of the complexation curves it was concluded that the total siRNA complexation occurs at the N/P 2 ratio for bPEI and N/P 4 for lPEI; and from DLS analysis emerged a bigger size (Figure 2A) and a lower surface charge (Figure 2B) of siRNA/lPEI complexes than those siRNA/bPEI.
Figure 2: DLS analysis results for siRNA/PEI complexes: A) size; B) Surface charge
After the chemical and physical characterization of the complexes, transfection experiments were performed for the validation of the siRNA sequences using jetPEI® as transfectant. The experiments conducted led to: i) the optimization of the siRNA dose to be used, i.e. 0.25 μg siRNA/well in a multiwell-96 plate; ii) the cellular type that would guarantee the best detectability of the fluorescence signal knock-down, i.e. HEK-EGFP MOI 0.1; iii) the optimization of the optimal seeding density for transfection experiments, i.e. 5 × 104 cells/cm2.
After siRNA validation, we performed transfection experiments using 25 kDa bPEI and lPEI. From the analysis of the results of the transfection experiments, performed in a range of N/P ratios 0-80, it emerged that the range of conditions that maximizes transfection efficiency and limit cytotoxicity of the complexes is that of N/P 12-20, only for siRNA/bPEI complexes, while siRNA/lPEI complexes were ineffective at all conditions tested. Given a cytotoxic effect and transfection efficiency of siRNA “naked”, we performed transfection experiments, leaving cells for 4 h after the administration of complexes in serum-free, in order to evaluate the dependence of these effect about an interaction among siRNA “naked” and serum proteins.
No cytotoxic effects of the "naked" siRNA were found on HEK cells transfected in serum-free cDMEM, thus ,confirming the hypothesis of the possible interaction with the serum proteins; and have confirmed the efficacy of only complexes prepared with bPEI at a N/P ratio of 15 (Figure 3A), instead those prepared with lPEI are inefficient (Figure 3B). The transfection efficiency of bPEI is comparable with that of Lipofectamine, considered highly performing [14], [15].
Figure 3: Transfection Efficiency in serum-free medium results: A) siRNA/bPEI; B) siRNA/lPEI
The simulations carried out at N/P ratio 15, showed no differences about SASA and APBS parameters for siRNA/bPEI and siRNA/lPEI complexes (Figure 4). This is contrast with the results of the experiments (DLS) which display important differences in size and surface charge parameters, depending on PEI used.
Figure 4: APBS analysis results: A) siRNA/bPEI; B) siRNA/lPEI
CONCLUSIONS AND FUTURE DEVELOPMENTS
The aim of this thesis was to find a correspondence between experimental and computational approach regard complexation and transfection parameters, in order to develop a tool for complexes screening.
The transfection experiments demonstrate that the best transfection condition is N/P ratio 15-20 with complexes prepared with bPEI and siRNA dose of 0.25 μg siRNA/well,
From a computational point of view, no literature has been found to simulate realistic complexation conditions, as in all literature studies found, PEI with molecular weight < 2 kDa are used [16], [17]. In this study, instead, the analysis of more realistic systems that simulate the complexation of PEIs, also used in the transfection experiments, at the N/P ratio conditions identified as optimal (ratio N/P 15), was tackled. However, the results of the simulations did not confirm the differences of chemical-physical parameters, especially of surface charge, between complexes depending on the PEI used. This seems to lead to consider the approximations introduced at the simulations level too significant, in order to maintain parallelism with the experimental conditions.
The simplifications introduced into the system in order to carry out the study are therefore too accentuated, so much to cause the loss of significant differences that should be found by the results of the simulations.
In perspective, further studies will aim to investigate a possible dependence of the results obtained in the simulations by the particular initial configuration, necessarily imposed on the molecules of the system. It would be useful to evaluate, not only the phenomenon of complexation, but also that of the internalization of the complexes by modeling the cell membrane and evaluating the nucleic acid release inside intracellular environment.
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