ING - Scuola di Ingegneria Industriale e dell'Informazione
28-apr-2021
2019/2020
La terapia cellulare adottiva (ACT) è una tecnica immunoterapeutica che consiste nell’attivazione ed espansione di linfociti T autologhi in vitro e nella loro successiva reintroduzione nel paziente. Essa fornisce un’alternativa al trattamento di patologie che richiedono l’azione del sistema immunitario, tra le quali il cancro.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato l’ottimizzazione e la verifica di un protocollo, preliminarmente sviluppato in un lavoro di tesi precedente, per la funzionalizzazione di un substrato innovativo per l’espansione in vitro di linfociti T. Più nel dettaglio, il principale obiettivo è stato verificare l’effettiva capacità di supporto dell’attivazione e della conseguente espansione dei linfociti T coltivati sul substrato funzionalizzato per un potenziale utilizzo del sistema nell’ambito di ACT. Come substrato è stata utilizzata una schiuma di ossido di grafene ridotto, che, grazie alle ottime proprietà strutturali, risulta particolarmente adatta all’applicazione. Il protocollo di funzionalizzazione prevede l’utilizzo di acido 4-(1-pirenil)-butirrico (PBA), attivato con EDC e sulfo-NHS per creare un legame con la streptavidina. La funzionalizzazione è stata ultimata tramite anticorpi biotilinati αCD3 e αCD28, sfruttando il legame altamente specifico tra streptavidina e biotina. Per poter valutare l’efficacia degli anticorpi immobilizzati ed ottenere un controllo da comparare alla schiuma in termini di stimolazione mediante αCD3 e αCD28, è stata proposta la fabbricazione di un rivestimento bidimensionale su cui immobilizzare i medesimi anticorpi. Come controllo positivo dell’attivazione linfocitaria, è stata considerata la stimolazione mediante fattori solubili (forbolo-12-miristato-13-acetato- PMA, e fitoemoagglutinina- PHA). Per la verifica dell’attivazione delle cellule, è stato ottimizzato un protocollo di valutazione della trascrizione dell’interleuchina-2 (IL2) tramite reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR), scegliendo come modello cellulare la linea Jurkat E6.1.
Adoptive cell therapy (ACT) is an immunotherapeutic technique that consists in the in vitro activation and expansion of autologous T lymphocytes and their subsequent reintroduction into the patient. This technique provides an alternative to treating diseases that require the action of immune system, such as cancer.
The aim of this master thesis project was the optimization and verification of a protocol, that was previously developed in a thesis, for the functionalization of an innovative substrate for in vitro expansion of T lymphocytes. In particular, the main purpose was to verify the ability of substrate to support the activation and consequent expansion of T lymphocytes grown on the functionalized support for a potential use of the system within the ACT. A reduced graphene oxide foam was used as substrate, which is particularly suitable for the application thanks to its excellent structural properties. The functionalization protocol involves the use of 4- (1-pyrenyl) -butyric acid (PBA), activated with EDC and sulpho-NHS in order to create a bond with streptavidin. Functionalization was completed by biotylinated αCD3 and αCD28 antibodies, exploiting the highly specific binding between streptavidin and biotin. In order to evaluate the effectiveness of immobilized antibodies and obtain a control to be compared to the foam in terms of stimulation by means of αCD3 and αCD28, the fabrication of a two-dimensional coating on which the same antibodies are immobilized has been proposed. As a positive control, stimulation by soluble factors (phorbol-12-myristate-13-acetate-PMA, and phytohemagglutinin-PHA) was considered. For the verification of cell activation, a protocol for evaluating the increase in interleukin-2 (IL2) transcription by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was optimized, choosing Jurkat line E6.1 as cellular model.