ING - Scuola di Ingegneria Industriale e dell'Informazione
9-apr-2024
2022/2023
Gli idrogeli iniettabili sono una categoria di idrogeli in grado reticolare in vivo una
volta iniettati dove designato, passando dallo stato in soluzione o in forma di pre-gel
adatto all’iniezione allo stato reticolato adatto all’impianto in vivo.
Gli idrogeli iniettabili hanno acquistato enorme interesse in campo biomedico
soprattutto in anni recenti. Questo è dovuto alle loro specifiche caratteristiche, come
la mininvasività dell’intervento chirurgico richiesto, la facile incorporazione di
componenti biologici al loro interno e la capacità di adattarsi alla geometria del sito
di inserimento.
Vari meccanismi di reticolazione, sia fisici che chimici, sono stati studiati per ottenere
idrogeli iniettabili dalle adeguate proprietà fisico-chimiche. Un meccanismo
largamente poco studiato per tale applicazione è l’uso dell’interazione biotina avidina, o biotina-streptavidina, rappresentante uno dei legami non covalenti di
maggiore specificità e robustezza, caratterizzato da un’altissima costante di
dissociazione dovuta ad un’estrema affinità tra biotina e avidina o streptavidina.
In questo lavoro sono stati sintetizzati acidi ialuronici biotinilati, capaci quindi di
sfruttare l’interazione biotina-streptavidina come meccanismo di reticolazione,
puntando ad applicarli come idrogeli iniettabili. Simili acidi ialuronici biotinilati sono
stati precedentemente realizzati in letteratura, ottenendo dei primi risultati che
mostrano la funzionalità dell’interazione biotina-avidina come meccanismo di
reticolazione in vivo per idrogeli, ma non riuscendo ad ottenere le proprietà
meccaniche adatte ad applicazioni come l’incapsulamento cellulare e di farmaci.
Lo scopo di questa tesi è dunque migliorare l’efficacia di questo meccanismo di
reticolazione e delle proprietà meccaniche risultati tramite l’aggiunta di un
distanziatore tra la catena principale di acido ialuronico e la biotina. L’ipotesi alla
base è che distanziare la biotina dalla catena principale dell’acido ialuronico
comporti un miglioramento nella capacità di legame tra la biotina e l’avidina, grazie
alla diminuzione dell’ingombro sterico causato dalla catena di acido ialuronico sulle
molecole di biotina. Maggiore la lunghezza del distanziatore, quindi, maggiore il
miglioramento in proprietà meccaniche. Per confermare tale ipotesi sono dunque
stati realizzati diversi acidi ialuronici biotinilati aventi distanziatori diversi in
lunghezza e gruppi chimici.
iv
Si è poi definito un metodo di quantificazione semi-quantitativo per il valore di
biotinilazione per uno degli acidi ialuronici biotinilati prodotti, basato sull’analisi
degli spettri H
1 -NRM e F 19 -NMR.
In seguito alla caratterizzazione chimica, per i prodotti in cui è stato possibile si è
condotta un’analisi reologica, valutando la viscosità dei prodotti in soluzione in
assenza e in presenza di streptavidina. Quest’ultima dovrebbe causare la
reticolazione del materiale legandosi alla biotina e quindi ad aumento della viscosità,
provando quindi l’avvenuta reticolazione. Questo aumento di viscosità portato
dall’aggiunta di streptavidina si prevede cresca all’incrementare della lunghezza
dello spacer, indicando quindi una maggiore reticolazione e migliori proprietà
meccaniche, validando così l’ipotesi di base discussa in precedenza.
Injectable hydrogels are a type of hydrogels able to crosslink in vivo after injection at
the target site, passing from the sol or pre-gel state suitable for the injection to
crosslinked state designed for the in vivo implant. They have attracted significant
attention in biomedical applications, especially in recent years. This is due to their
unique features, such as the mini-invasive surgical procedure required for the
administration, the ease of incorporating biological components, and their ability to
conform to the geometry of the target site.
Various crosslinking mechanisms, both physical and chemical, have been studied to
achieve injectable hydrogels with proper physico-chemical properties. One largely
unexplored mechanism for this purpose is the biotin-avidin (or biotin-streptavidin)
interaction, which constitutes one of the most specific and robust noncovalent bonds.
This interaction is characterized by a high dissociation constant due to the strong
affinity between biotin and avidin, or streptavidin.
In this thesis, biotinylated hyaluronic acids have been synthetized, enabling the
utilization of the biotin-streptavidin interaction as a crosslinking mechanism, with
the goal of their application as injectable hydrogels. Similar biomaterials have been
previously developed in other studies, demonstrating the functionality of this
mechanism for in vivo crosslinking. However, they did not achieve the mechanical
properties useful for applications such as cell and drug encapsulation.
Thus, the aim of this thesis is to enhance the efficacy of this mechanism and the
resulting mechanical properties by introducing a spacer between hyaluronic acid
backbone and biotin. The basic hypothesis is that increasing the distance between
biotin and the hyaluronic acid backbone would enhance the ability of biotin to bind
avidin or streptavidin, due to the steric hindrance reduction caused by hyaluronic
acid backbone on biotin molecules. Consequently, longer spacer lengths are expected
to lead to greater improvements in mechanical properties. To evaluate this
hypothesis various biotinylated hyaluronic acid have been synthetized, characterized
by spacer different in length and chemical groups.
In addition, a semi-quantitative quantification method was developed to determine
the degree of biotinylation for one of these synthetized biotinylated hyaluronic acids,
based on the H
1 -NRM and F 19 -NMR spectra.
After chemical characterisation, rheological analysis was conducted on the products,
where applicable, to assess their viscosity in solution both with and without
ii
streptavidin. The presence of streptavidin should induce hydrogel crosslinking
through its interaction with biotin, resulting in an increase in viscosity compared to
the product without streptavidin, thus providing evidence of effective crosslinking. It
is expected that the viscosity difference between samples with and without
streptavidin will increase with longer spacer lengths, indicating enhanced
crosslinking and mechanical properties, thus validating the underlying hypothesis
discussed earlier.