3D bioprinting of aortic-like constructs with a novel double crosslinked dECM-bioink

The recent advent of 3D bioprinting, one of the most cutting-edge Tissue Engineering techniques, has raised several stimulating challenges. The main ambition of 3D bioprinting is to print stable three-dimensional (3D) structures and simultaneously allow cell viability and proliferation. For this reason, that technique aims to reproduce a 3D cellularized environment with biological properties like the native extracellular matrix (ECM) with precise and reproducible geometric features. In recent years, the trend has been to combine decellularization with 3D bioprinting, adding in the printable biomaterial decellularized extracellular matrix (dECM). In this way, the principal components present in the extracellular environment that mediate the processes of cell migration, proliferation, and differentiation, are available in the bioink. This is the background of the present Master Thesis project, which aims to 3D print cellularized aortic constructs with significant height and native dimensions. To achieve this goal, a bioink enriched with decellularized, freeze-dryed, and digested porcine aorta ECM was optimized. Thus, the project started with the synthesis of a bioink made of alginate, gelatine, and dECM that would allow low printing pressures while maintaining shape both during the printing process and afterward. For this reason, an innovative double-crosslinking process of alginate was adopted. That method involved an internal pre-printing reticulation given by glucono-δ-lactone (GDL) and calcium carbonate (CaCO3) and a post-printing external crosslinking immersing the constructs in a 1% (w/v) solution of calcium chloride dihydrate (CaCl2). Several bioink compositions were analyzed with a trial-and-error approach until the optimum was reached: 6% (w/v) alginate, 1.2% (w/v) gelatine, and 0.66% (w/v) porcine aorta dECM. The CAD (Computer Aided Design) model of the aortic segment was designed with Fusion 360 software reproducing the wall thickness dimensions and the inner diameter typical of the native aorta. Then, the G-code generation was performed using HeartWare software. The 3D bioprinter Inkredible+ was used for the bioprinting process, which allows the bioprinting with two extruders, therefore, the eventual extrusion of different cell types. The final bioink composition allowed the printing of aortic constructs of about 1.5 cm, equivalent to 40 layers, maintaining their structure over time. After optimizing the design and cross-linking of the bioink, its characterization was carried out. Firstly, the shape maintenance of the constructs after the printing and crosslinking processes was analyzed and quantified. Then, a preliminary analysis of the behavior of the printed vessels in an aqueous environment was conducted. Thanks to the promising results of these evaluations, the characterization was carried on with swelling and degradation tests. The latter demonstrated a slow degradation rate of constructs bioprinted with dECM-bioink. In addition, rheological tests characterized the contribution of the two crosslinking steps and analyzed both the kinetics of the internal crosslinking and the shear thinning behavior of the novel synthesized bioink. Finally, to biologically characterize the dECM-based hydrogel, constructs were printed with embedded immortalized mouse fibroblasts. Live&Dead assays from 24 hours after printing were performed to evaluate the cytocompatibility of the printing process and of the novel biomaterial. Finally, an optical microscope monitored cell proliferation and infiltration in the bioprinted constructs for up to 28 days of static culture.

Il recente avvento del 3D bioprinting, che si vede annoverato tra le più avanguardistiche tecniche di Ingegneria Tissutale, ha portato con sé diverse stimolanti sfide. Il 3D bioprinting ha infatti come principale obiettivo quello di conciliare la stampa di stabili strutture tridimensionali (3D) che permettano allo stesso tempo la vitalità e la proliferazione cellulare. Questa tecnica mira, inoltre, a riprodurre un ambiente tridimensionale cellularizzato, con proprietà biologiche simili alla matrice extracellulare (ECM) nativa e con caratteristiche geometriche precise e riproducibili. Negli ultimi anni, la tendenza è quella di combinare la decellularizzazione con il bioprinting, aggiungendo al biomateriale stampabile matrice extracellulare decellularizzata (dECM). In questo modo, i principali componenti presenti nell'ambiente extracellulare, che mediano i processi di migrazione, proliferazione e differenziazione cellulare, sono presenti fisicamente nel bioink. In quest’ottica si colloca il presente lavoro di Tesi Magistrale che ha come obiettivo la biostampa di costrutti aortici cellularizzati con un’altezza significativa e dimensioni native. Per questo, è stato ottimizzato un bioinchiostro arricchito con dECM di aorta porcina, liofilizzata e digerita. Il progetto è stato sviluppato partendo dalla sintesi di un bioink a base di alginato, gelatina e dECM che permettesse basse pressioni di stampa ma che allo stesso tempo mantenesse la forma sia durante il processo di bioprinting che successivamente. Questo obiettivo è stato raggiunto grazie all’ottimizzazione di un innovativo doppio processo di reticolazione dell’alginato. Tale metodo prevede una reticolazione interna pre-stampa data dalla reazione tra GDL (glucono-δ-lattone) e carbonato di calcio (CaCO3), e una seconda reticolazione esterna condotta subito dopo la stampa tramite l’immersione dei costrutti in una soluzione 1% (w/v) di calcio cloruro diidrato (CaCl2). Diverse composizioni di bioink sono state analizzate con un approccio trial-and-error per arrivare all’optimum: 6% (w/v) alginato, 1.2% (w/v) gelatina e 0.66% (w/v) dECM porcina, che soddisfacesse tutti i prerequisiti. Il modello CAD (Computer Aided Design) del costrutto aortico è stato sviluppato col software Fusion 360 rispettando le dimensioni di spessore della parete e diametro interno dell’aorta nativa. Invece, la generazione del G-code è stata effettuata utilizzando il software HeartWare. Per il processo di bioprinting è stata utilizzata la 3D bioprinter Inkredible+ che ha permesso la stampa con due estrusori, simulando in un primo momento, l’utilizzo di più tipi cellulari. La composizione finale del bioink ha permesso la stampa di costrutti aortici di circa 1,5 cm, equivalenti a 40 layer, mantenendo la loro struttura nel tempo. A seguito dell’ottimizzazione della composizione e della reticolazione del bioink, è stata effettuata la sua caratterizzazione. In primo luogo, è stato analizzato e quantificato il mantenimento di forma dei costrutti a seguito del processo di stampa e reticolazione, per poi effettuare una prima analisi del comportamento dei vasi stampati in ambiente acquoso. Visti i risultati promettenti di queste analisi preliminari, la caratterizzazione è proseguita con i test di rigonfiamento e quelli di degradazione, questi ultimi hanno dimostrato una lenta degradazione dei costrutti stampati con dECM-bioink. Inoltre, le prove reologiche svolte hanno permesso di caratterizzare il contributo delle varie fasi di reticolazione, di analizzare la cinetica del primo step di reticolazione interna e il comportamento pseudo-plastico del bioink sintetizzato. Infine, per caratterizzare biologicamente l’idrogelo a base di matrice extracellulare, sono stati stampati costrutti con inglobati fibroblasti immortalizzati di topo. Per la valutazione della citocompatibilità del processo di stampa e del nuovo biomateriale sono stati effettuati saggi Live&Dead a partire da 24 ore dalla stampa. Invece, la proliferazione e l’infiltrazione delle cellule stampate all’interno del costrutto è stata monitorata fino a 28 giorni di coltura statica tramite microscopio ottico.