Novel ester cross-linked acrylate based hydrogel as bone graft material

Bone is a tissue which provides many essential functions in human body. The main functions are protection and scaffolding, necessary for movement and support [1], but bone also maintains homeostatic levels of calcium and bone marrow provides a source of hematopoietic stem cells [2]. Unfortunately bone and joints are often subjected to injuries, leading to musculoskeletal conditions. The musculoskeletal diseases are such increasing that bone is become the second most common transplant tissue after blood, with the iliac crest autologous graft being most used [14]. Due to the limited availability of autografts, research is now focusing on finding substitutes capable of inducing bone tissue regeneration. In 2010, the bone graft substitutes market were valued $1.3 billion in the USA, with a forecast of $2.3 billion in 2017 [10]. The development of an artificial bone graft is particularly important and bone tissue engineering is a promising alternative to autograft for bone regeneration. Synthetic graft substitutes combine scaffolding properties with biological elements to stimulate cell proliferation and differentiation and eventually osteogenesis [14]. Promising materials to be used as synthetic bone graft substitutes are hydrogels. Hydrogels are materials that swell but do not dissolve in water, maintaining a distinct 3D network structure by virtue of crosslinks [17] and their high content of water let them mimic the composition of biological tissues. On the other hand their mechanical properties are scarce and cannot be applied in load-bearing situation, but to date none of the bone substitutes proposed are load bearing [18]. Therefore, when required, the mechanical support is provided by fixation devices [19]. Hydrogels are particularly interesting because they can be used to deliver cells, drugs or proteins, which can improve osteogenesis, osteoconduction or osteoinduction when used as a bone graft. However, the main reason for which research is focusing on the use of hydrogels for bone regeneration, is their injectability [20]. The main advantage of injectable materials compared to 3D scaffold is that they can be applied using non-invasive or minimally invasive surgeries and they can fill irregularly shaped bone defect easily. Therefore, using an injectable hydrogel, instead of an autologous bone graft, has a double advantage: the primary surgery to implant the gel would be non-invasive and the secondary surgery to explant the graft is avoided. In the development of injectable hydrogels, two main classes of materials have been used, which are: natural and synthetic polymers[20]. Among the synthetic polymers the most studied are PEG-based hydrogels. In this thesis work a novel PEG-based injectable hydrogel is characterised to study its applicability as bone graft substitute. Materials and methods The novel hydrogel was prepared mixing 2ml of PEGMEMA (poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate), 1ml of DEM (2-(Dimethylamino)ethyl) and cross-linker in different concentration: 1, 5, 10, 20% (v/v); all added to 5ml of deionized water , in which was dissolved 10 mg of Ammonium persulphate (APS). As cross-linker was used 1,4-Butanediol dimethacrylate. These gels were tested both with 10mg/ml of alfa tricalciumphosphate (TCP) and without it, which were added to the water solution. Also ZnCl2 and SrCl2 salts were added to the aqueous phase at various concentrations, individually or together. The work was divided into three sections: 1) physico-chemical characterization; 2) cell viability and osseoinductivity testing; 3) material tests; The physico-chemical characterization gives a first analysis of the material and its polymerization reaction. The first test conducted was the swelling test, which was necessary to find the most handily gel formulation, in terms of both application and testing. For the reaction characterization two tests are reported: a temperature test and a pH test. The cell viability and osseoinductivity tests were necessary to investigate the gels cytocompatibility and their osseoinductivity properties. These tests were performed with MTT and Alizarin red assays. In this section a further test is reported, which is an antimicrobial test. The material test section wants to give a complete material characterization and to analyse the material capability of forming hydroxyapatite. First of all some rheological tests were performed to investigate the gels mechanical properties. Furthermore, XRD tests are reported with the aim to verify the presence of hydroxyapatite on gels. A further test performed was the ion release test, which investigated the material ion release capability. As a final characterization, SEM analyses were carried out with the purpose to study the gel morphology and to verify the formation of hydroxyapatite deposits. Results and Discussion The results of swelling test showed a range of swelling between 100% and 200%, while temperature and pH tests have shown that the values during polymerization are acceptable from an applicative point of view, with the highest temperature increment of 16°C and highest pH values between 9.5 and 10. Cell viability and osseoinductivity tests showed that the material has poor antimicrobial properties, but acceptable cytocompatibility. The alizarin red test for calcium production showed best results for gels with 20% of cross-linker and higher concentrations of strontium (100 mM). For what concern the material tests section the rheology tests showed surprising high values of G’ modulus for fresh gels (with a maximum value of 86 kPa for 20% cross-linker sample with TCP) and lower values (around units of Pa) for swelled gels. Results of XRD test and SEM pictures showed the presence of hydroxyapatite deposits after only one month from the immersion in SBF (Fig. 2). Finally results of ion release test showed that the material has the capability to release particles for about two months with a slight decrement during time. Conclusions Characterization tests performed on PEG-based hydrogels have proven the peculiar and interesting properties of the novel material proposed in this work making them as a promising approach to bone defect repairs. First of all the mechanical properties of the hydrogel are unique, with elevated storage modulus and low viscous modulus, which can be helpful for bone tissue applications. Secondly the temperature increment and pH values during polymerization are acceptable, that means that gels can be used as injectable material, minimizing the risks of traumas and infections during the surgery. Another important quality of the gel is the capability of forming hydroxyapatite deposits already after one month, which are particularly important in the developing process of the mineralized extracellular matrix in bone tissue applications. Finally the viability and calcium production tests showed that the material is non-cytotoxic and can promote calcium production. The calcium production properties showed to be better in presence of salts like strontium, which is known to be an osteoinductive material. The joint action of osteoinductive salts and the capability of forming hydroxyapatite deposits, due to the gel itself, can lead to a better and quicker formation of extracellular matrix. To conclude, the PEG-based hydrogels here described are very interesting and they could be used in future bone tissue engineering application. Despite the promising findings shown in this thesis work, further investigations and characterization are needed. For example in vivo tests should be performed to study the material capability to promote tissue regeneration in a biological environment. In vivo tests would be important also to check if the lack of porosity could be a limitation for this material in terms of applicability.

Introduzione L’osso è un tessuto che svolge diverse funzioni all’interno del corpo umano. Le principali funzioni sono protezione e sostegno, necessarie per il movimento e il supporto [1], ma l’osso mantiene anche i livelli omeostatici di calcio e il midollo osseo è una fonte di cellule staminali ematopoietiche [2]. Sfortunatamente ossa e giunture sono spesso soggetti a infortuni che determinano disturbi muscolo scheletrici. Le malattie muscolo scheletriche sono in aumento, tanto che l’osso è diventato il secondo tessuto più trapiantato dopo il sangue, con il trapianto autologo della cresta iliaca ad essere il più usato [14]. A causa della limitata disponibilità degli autograft, la ricerca si sta focalizzando nel trovare sostituti capaci di indurre la rigenerazione del tessuto osseo. Nel 2010 il mercato dei sostituti al trapianto osseo valeva 1.3 miliardi di dollari negli USA, con una previsione di 2.3 miliardi per il 2017 [10]. Lo sviluppo di un trapianto osseo artificiale è pertanto molto interessante e l’ingegneria dei tessuti è un’alternativa promettente all’autograft per la rigenerazione dell’osso. I sostituti sintetici combinano proprietà di scaffolding ad elementi biologici per stimolare la proliferazione e differenziazione cellulare ed eventualmente anche l’osteogenesi [14]. Gli idrogeli sono materiali molto promettenti da utilizzare come sostituti sintetici a trapianti ossei. Gli idrogeli sono materiali che assorbono l’acqua senza disciogliersi, mantenendo un network tridimensionale [17] e il loro elevato contenuto acquoso gli consente di mimare la composizione dei tessuti biologici. D’altro canto le loro proprietà meccaniche sono scarse e non possono essere usati in applicazioni sotto sforzo, ma fino ad oggi nessun sostituto osseo proposto è in grado di farlo [18]. Pertanto, quando richiesto, le proprietà meccaniche saranno fornite da appositi supporti o fissatori [19]. Gli idrogeli sono particolarmente interessanti perché possono essere usati per trasportare cellule, farmaci o proteine, che possono aumentare l’osteogenesi, l’osteoconduzione o l’osteoinduzione se usati per la rigenerazione dell’osso. Tuttavia, la ragione principale per cui la ricerca si sta focalizzando sull’utilizzo degli idrogeli nel campo dei trapianti ossei, è la loro possibilità di essere iniettati [20]. Il vantaggio principale di un materiale iniettabile rispetto ad uno scaffold 3D è il fatto di poterli applicare tramite chirurgie non-invasive o mini-invasive e che possono riempire facilmente difetti dalle forme irregolari. Pertanto usare un idrogelo iniettabile, invece di un trapianto osseo autologo, ha un doppio vantaggio: l’operazione primaria per impiantare il gel sarebbe non-invasiva e l’operazione secondaria sarebbe evitata. Nello sviluppo di idrogeli iniettabili sono state usate due classi principali di materiali, che sono: polimeri naturali e sintetici [20]. Tra i polimeri sintetici i più studiati sono quelli a base di PEG. In questo lavoro di tesi un idrogelo iniettabile e innovativo a base di PEG è caratterizzato per studiarne l’applicabilità come sostituto di trapianti ossei. Materiali e metodi L’idrogelo è stato preparato mescolando 2ml di PEGMEMA (poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate), 1ml di DEM (2-(Dimethylamino)ethyl) e cross-linker a diverse concentrazioni: 1, 5, 10, 20% (v/v); tutte mescolate a 5ml di acqua deionizzata, nella quale sono stati sciolti 10mg di ammonio persolfato (APS). Come cross-linker si è usato 1,4-Butanediol dimethacrylate. Questi gel sono stati testati sia con 10mg/ml di alfa tricalciofosfati(TCP), aggiunti alla fase acquosa, che senza. Anche sali di ZnCl2 e SrCl2 sono stati aggiunti alla fase acquosa da soli o insieme, a diverse concentrazioni (Fig.1). Il lavoro è stato diviso in tre sezioni: 1) caratterizzazione fisico-chimica; 2) test di vitalità cellulare e osteoinduzione; 3) test del materiale; La caratterizzazione fisico-chimica dà una prima analisi del materiale e della sua reazione di polimerizzazione. Il primo test eseguito è stato quello di rigonfiamento, necessario per trovare la formulazione più maneggevole in termini applicativi e pratici. Per la reazione di polimerizzazione sono riportati due test: test della temperatura e del pH. I test di vitalità cellulare e osteoinduttività sono necessari per studiare le proprietà di citocompatibilità e osteoinduttività dei gel. Questi test sono stati eseguiti con saggi MTT e alizarina rossa. In questa sezione è riportato un ulteriore test, quello antimicrobico. La sezione dei test sul materiale vuole dare una completa caratterizzazione del materiale e studiare la capacità dello stesso di formare idrossiapatite. Innanzitutto sono stati eseguiti dei test reologici per studiare le proprietà meccaniche. Sono poi riportati test XRD, che hanno lo scopo di verificare la presenza di idrossiapatite; test di rilascio di ioni, per studiare la capacità di rilascio di ioni da parte del materiale nel tempo ed infine l’analisi al SEM per lo studio della morfologia e la verifica della presenza di depositi di idrossiapatite sui gel. Risultati e Discussione I risultati del test di swelling hanno mostrato un range di valore compreso tra 100% e 200%, mentre i test di temperatura e pH hanno provato che i valori raggiunti in fase di polimerizzazione sono accettabili dal punto di vista applicativo, con un incremento di temperatura massimo di 16°C e un valore di pH massimo compreso tra 9.5 e 10. I test di vitalità cellulare e osteoinduzione hanno dato prova delle scarse proprietà antimicrobiche del materiale, ma accettabile citocompatibilità. Il test con alizarina rossa per l’analisi della produzione di calcio ha dato i risultati migliori con il gel a 20% di cross-linker e le più alte concentrazioni di stronzio (100 mM). Per quanto riguarda la sezione dei test sul materiale, i test reologici hanno riportato valori sorprendentemente elevati di modulo G’ per i gel appena preparati (con un valore massimo di 86kPa per il gel a 20% di cross-linker e con TCP) e valori inferiori (attorno alle unità di Pa) per i gel rigonfiati. I risultati dei test di XRD e SEM hanno mostrato la presenza di depositi di idrossiapatite dopo appena un mese dall’immersione in SBF (Fig. 2). Conclusioni I test di caratterizzazione eseguiti sugli idrogeli hanno provato che questo materiale innovativo possiede proprietà peculiari e interessanti, rendendolo un promettente approccio per la cura di difetti ossei. Innanzitutto le proprietà meccaniche dell’idrogelo sono uniche, con un elevato modulo elastico e basso modulo viscoso, il che può essere d’aiuto per le applicazioni nel campo dei tessuti ossei. In secondo luogo l’aumento di temperatura e i valori di pH in fase di polimerizzazione sono accettabili, il che significa che i gel possono essere utilizzati come materiale iniettabile, minimizzando i rischi di trauma e infezioni durante l’operazione. Un’altra importante qualità del gel è la sua capacità di formare depositi di idrossiapatite già dopo un mese, questo è particolarmente importante nel processo di sviluppo di una matrice extracellulare mineralizzata. Infine i test di vitalità e produzione di calcio hanno dimostrato che il materiale è non-citotossico e può promuovere la produzione di calcio. Le proprietà di produzione di calcio sono risultate essere migliori in presenza di sali come lo stronzio, che è noto essere un materiale osteoinduttivo. L’azione coniugata di sali osteoinduttivi e la capacità di formare depositi di idrossiapatite, data dallo stesso gel, possono portare ad una migliore e più rapida formazione di matrice extracellulare. In conclusione, l’idrogel qui descritto è risultato essere molto interessante e potrebbe essere utilizzato in futuro per applicazioni nel campo della rigenerazione dei tessuti ossei. Ma prima di fare ciò, nonostante i risultati promettenti descritti nel presente lavoro di tesi, ulteriori studi e caratterizzazioni devono essere condotti. Ad esempio dovrebbero essere condotti dei test in vivo per studiare la capacità del materiale di promuovere la rigenerazione dei tessuti in un ambiente biologico. I test in vivo sarebbero inoltre utili per capire se l’assenza di porosità mostrata dal materiale possa essere una limitazione in termini di applicabilità.