Engineered transaminases in aqueous organic solvent solutions : a new tool for the synthesis of stereoselective amines

The goal of this project was to improve the tolerance of Chromobacterium violaceum (S)-amine transaminase towards increasing concentration of the polar organic solvent dymethylsulfoxide (DMSO). The protein engineering strategies employed were B-factor method and rational design. Ten active mutants were identified and tested at different concentration of DMSO and isopropylamine (IPA) over time and their performances were then compared with Chromobacterium violaceum and Vibrio fluvialis wild types data. Two mutants, CV E48D/K193T and CV K193I, resulted to be more active and more stable than the two wild types. In particular the variant CV E48D/K193T was found to be resistent to thermal inactivation at 50°C. Asymmetric synthesis were performed with CV WT, CV K193I and CV E48D/K193T. For each enzyme twelve reactions were run: 2-acetonaphtone and 4-phenyl-2-butanone as substrate, isopropylamine concentration and closed/open reaction environment were the variable parameters. High conversion (95%) were obtained when the mutants reacted with 4-phenyl-2-butanone in open reaction environment, while poor conversions were achieved using the bulkier 2-acetonaphtone as amino acceptor .

Lo scopo di questa tesi sperimentale è stato il miglioramento della tolleranza dell'(S)-ammino transaminasi del Chromobacterium Violaceum (CV) a concentrazioni crescenti del solvente organico dimetilsulfossido (DMSO). Le strategie utilizzate per la mutazione dell'enzima utilizzato, sono state il B-factor method e il rational design. Dieci enzimi mutati attivi sono stati identificati. Le loro attività e stabilità sono state testate a diverse concentrazioni di DMSO e isopropilammina (IPA) e confrontate con quelle dell'enzima originale. Dal confronto dei dati, due enzimi mutati, CV E48D/K193T e CV_K193I, sono risultati essere più attivi e stabili. In particolare la variante CV_E48D/K193T è risultata essere più resistente all'inattivazione termica a 50°C. Successivamente, l'enzima originale e le due varianti migliorate sono stati utilizzati per condurre la sintesi asimmetrica partendo da due substrati: 2-acetonaftone e 4-fenile-2-butanone. Variando la concentrazione di donatore del gruppo ammino, IPA, e il tipo di ambiente reattivo (chiuso e aperto), sono state calcolate le rese dei tre biocatalizzatori. Nel caso in cui il 4-fenile-2-butanone è stato usato come substrato, le due transaminasi modificate hanno registrato un incremento significativo della resa in ammine rispetto all'originale.