Bioreactor for stem cell expansion : theoretical design, modelling of mass transfer and experimental evaluation of a stirred vessel

Abstract Motivation The world population is aging. As a consequence, the number of people affected by neurodegenerative diseases is constantly increasing, since the greatest risk factor is advancing age, in association with mitochondrial DNA mutation and oxidative stress damage [1] [2]. Despite the diffusion, the destructive nature and the health care cost sustained for these diseases, such as Alzheimer disease (AD), Parkinson disease (PD), Huntington disease (HD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Spinal muscular atrophy (SMA), the available therapies are not effective and the great majority of therapeutic interventions remains limited to palliative and symptomatic treatment. At the same time cellular therapies have earned increased attention, for the treatment of injury and diseases using cells or tissue grafts [3], even though the therapeutic application of these strategies to human diseases is still challenging [7]. In fact, the first limitation to stem cells based therapies and tissue engineering strategies is the lack of a source that provides high number of stem cells and thus the restricted availability of new tissue for transplants [7]. Consequently it is important the development of efficient methodologies for large-scale expansion of stem cells [9]. Problem statement This project includes different fields of Science, like Fluid Dynamic Engineering, Computer Programming, Chemical Engineering and Biological Engineering. The ability to obtain an adequate amount of cells for cellular therapies is still a limiting factor in the field of tissue regeneration. This project wishes to contribute, concerning the field of neural stem cells, to the development of systems suitable to expand at a large scale neural stem cells and neural tissue constructs. The aim of this work is the characterisation of an "In-house" developed prototype of a bioreactor, to evaluate its potential and its limitations, provide recommendation for its optimized condition to operate and to give general guidelines for a future configuration of bioreactor for neural stem cells expansion. It is essentially composed by an ellipsoidal vessel, a magnetic stir and six frames of nanofiber meshes for the seeding of NSCs, as shown in Figure 1. Approach To characterise the stirred vessel, the effect of two variables were studied: the fill volume of media used in the reactor: 25, 30 and 35 ml, and the rotational speed of the magnetic stir: 0, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 90 and 120. An in-depth analysis was carried out, taking into consideration the optimal distribution of nutrients, trying to minimize a concentration polarization of toxic products, and taking into consideration the cells' solicitation in terms of shear stress. Such analysis was developed following three main approaches: the first one consisted in an experimental assessment of the effect of liquid volume and stirring speed on mass transport with the limiting current technique, in order to quantify the concentration polarisation of toxic products, such lactate, and obtain an estimation of shear stress; the second one consisted in the theoretical modelling of the reactor vessel using computing fluid dynamics (CFD) to assess differences in shear stress solicitation among the scaffolds and velocity field in the vessel, due to changes in liquid volume and stirring speed; finally the third approach consisted in an experimental evaluation with NSCs cultured in the reactor at selected conditions, to evaluate veracity of theoretical results. Results The results highlighted the superiority of the 30 ml study-case. From the limiting current technique it was calculated the dimensionless Sherwood number, representing the ratio of convective to diffusive mass transport, and it turned out that mass transfer coefficient and Sherwood number were more homogeneously distributed along the vessel for the 30 ml study-case. Furthermore this homogeneity increased by increasing the rotational velocity of the stir from 60 rpm on, as presented in Figure 2. The mass transfer coefficient was also useful to estimate the lactate concentration in proximity of the scaffolds and it was proved that the differences among the scaffolds in different positions were smoothed for the 30 ml study-case, in comparison with the 25ml-case. From the computational fluid dynamic modelling it was possible to study the velocity field distribution and therefore understand that the superiority in mass transfer coefficient was probably due to the fact that the scaffolds were completely submerged in the 30 ml study-case, and the fluid was free to recirculate as shown in Figure 3. The shear stress colorimetric maps were useful to have an ulterior confirmation; in fact, the 30 ml study-case presented restricted variability in the values range and higher homogeneity in stimulus distribution among the scaffolds. Finally, the cell culture confirmed the previous results: a further confirmation that the fluid dynamic in the 30 ml study-case is such that the stimulus distribution is more regular along the vessel and as consequence cells grow more homogeneously distributed, while, in the 25 ml study-case, the external positions of the scaffolds are kind of neglected and consequently cell expansion is lower. Conclusions This research indicate that this path is viable to obtain a large number of stem cell for the previously described purposes, but the stirred vessel analysed during this work need further improvements than the ones already provided during this thesis. For this reason a redesign of a bioreactor is necessary to eliminate or minimize some weaknesses, starting from the gained experience during this work. Symmetry, homogeneity and simplicity are the three suggestion keywords for the future developments.

Sommario Introduzione Nella popolazione mondiale si registra un continuo aumento dell'età media e della durata della vita. Come conseguenza, diventa sempre maggiore il numero di persone colpite da malattie neurodegenerative, la cui incidenza è legata all'età, soprattutto per effetto di danni ossidativi e di mutazioni del DNA mitocondriale [1] [2]. Per queste malattie neurodegenerative, come l'Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica e l'atrofia muscolare spinale, nonostante la diffusione, la loro natura distruttiva e i costi sostenuti dalla sanità, non sono ancora disponibili terapie veramente efficaci e la maggior parte degli interventi terapeutici sono trattamenti palliativi e sintomatici. Nel frattempo le terapie cellulari stanno conquistando crescente interesse per il trattamento di lesioni e malattie con cellule o innesti di tessuti [3], ma le applicazioni terapeutiche di queste strategie sull'uomo sono ancora in fase di studio [7]. La principale limitazione infatti, all'applicazione di queste terapie basate sull'utilizzo di cellule staminali e tessuti ingegnerizzati è la mancanza di uno strumento che permetta di ottenere cellule staminali in quantità consone per riprodurre tessuti per trapianti [7]. è quindi di primaria importanza progettare e studiare nuovi strumenti con cui sia possibile ottenere l'espansione in larga scala di cellule staminali [9]. Formulazione del problema Questo progetto di tesi, spaziando su differenti campi della scienza come fluidodinamica, programmazione, ingegneria chimica e ingegneria biologica, vuole contribuire allo sviluppo di un sistema adatto all'espansione in larga scala di cellule staminali e tessuto neurali. L'obiettivo primario di questo studio è la caratterizzazione di un prototipo di bioreattore progettato nel Stem Cell Bioengineering Laboratory all'Instituto Superior Tecnico di Lisbona, con una valutazione del suo potenziale e dei suoi difetti. Il prototipo in analisi è composto essenzialmente da un vessel a sezione ellissoidale, un agitatore magnetico e sei scaffold di nanofibre per l'adesione di cellule staminali neurali (NSC), come presentato in Figura 1. Si forniranno inoltre istruzioni per l'ottimizzazione del suo funzionamento e si daranno indicazioni generali atte alla riprogettazione futura di bioreattori con lo stesso obiettivo: l'espansione di cellule staminali neurali. Approccio Il reattore è stato caratterizzato tramite l'effetto combinato di due variabili in gioco: il volume di riempimento, che varia tra 25, 30 e 35 ml; e la velocità di rotazione dell'agitatore magnetico, con i seguenti valori: 0, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 90 e 120 rpm. è stata svolta un'analisi approfondita, con riguardo ad una ottimale distribuzione dei nutrienti, tentando di minimizzare la polarizzazione in termini di concentrazione per prodotti tossici di scarto, e considerando la sollecitazione alle cellule in termini di sforzo di taglio. La suddetta analisi si sviluppa seguendo tre approcci principali: il primo, grazie alla tecnica di corrente limite, permette di indagare gli effetti del volume di riempimento utilizzato e delle velocità di rotazione dell'agitatore sul trasferimento di massa nel reattore, con l'obiettivo di quantificare la polarizzazione di prodotti tossici come il lattato e ottenere una stima dello sforzo di taglio. Il secondo, sfruttando la modellizzazione teorica del reattore, costruito con un software per l'analisi computazionale della fluidodinamica, indaga le differenze di sollecitazione tra gli scaffold e il campo di velocità nel reattore al variare del volume di riempimento e della velocità di rotazione dell'agitatore. Infine, il terzo approccio consiste in una valutazione sperimentale del reattore con una coltura di NSCs alle condizioni scelte, per valutare la veridicità dei risultati ottenuti con i precedenti approcci. Risultati I risultati, per quanto concerne i parametri analizzati, mostrano la superiorità del caso studiato con 30 ml di volume di riempimento. Dalla tecnica di corrente limite è stato calcolato il coefficiente di trasferimento di massa che, insieme al numero adimensionale di Sherwood, che rappresenta il rapporto tra trasferimento di massa convettivo, risulta meglio distribuito lungo il reattore per il caso studiato con 30 ml. Questa omogeneità di distribuzione inoltre aumenta per velocità dell'agitatore magnetico comprese tra 60 e 120 rpm. Il coefficiente di trasferimento di massa è stato utilizzato inoltre per stimare la concentrazione di lattato in prossimità degli scaffold e si è giunti alla conclusione che le differenze tra scaffold sono più attenuate per il caso studiato con 30 ml, in contronto a quello con 25 ml. Dai modelli computazionali è stato possibile ricavare la distribuzione delle velocità e quindi capire l'origine della superiorità, da molti punti di vista, del caso con 30 ml. Infatti è stato possibile notare che i supporti per le cellule erano completamente sommersi dal mezzo, il quale poteva fluire sopra essi, permettendo un ricircolo maggiore di nutrienti. Mappe colorimetriche di sforzo di taglio hanno fornito un'ulteriore conferma che il caso studiato con 30 ml presenta una minore variabilità nei range di valori massimi e minimi per gli scaffold e maggiore omogeneità nella distribuzione dello stimolo nel reattore. Infine le colture cellulari hanno confermato i risultati ottenuti: la fluidodinamica del caso da 30 ml è migliore in termini di distribuzione più regolare dello stimolo e, di conseguenza, la crescita cellulare registrata risulta più omogeneamente distribuita. Al contrario, nel caso studiato con 25 ml, le posizioni più esterne degli scaffold sono trascurate dal flusso di nutrienti e di conseguenza la crescita cellulare registrata è minore. Conclusioni Il presente studio traccia una strada valida per ottenere un numero di cellule adeguato agli obiettivi precedentemente descritti, mentre, per quanto riguarda il reattore, sono opportuni ulteriori miglioramenti per ottimizzare alcuni aspetti progettuali dimostratisi non ottimali durante questo lavoro di tesi. Simmetria, omogeneità e semplicità sono i tre suggerimenti chiave per future progettazioni in questa direzione.