Design of a microfluidic device for cyclic mechanical stimulation of three dimensional cardiac cell constructs

The goal of this thesis was to develop a novel microbioreactor for applying, as uniformly as possible, a uniaxial cyclic mechanical strain to 3D cardiac constructs. To achieve this aim, a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microbioreactor has been designed with two separated compartments: an upper culture chamber dedicated to host and culture 3D cell-laden hydrogels, and a lower pressure-actuated compartment, which provides the mechanical stimulation. The design and development phases of the microfluidic system were carried out at the Micro and Biofluid dynamics Laboratory (μBS Lab), Department of Electronics, Information and Bioengineering of Politecnico di Milano. Upon design and fabrication phases, the microfluidic system was biologically validated at the Cardiac Surgery and Engineering group, Department of Biomedicine of Basel University Hospital. In details, two different 3D microscale cardiac constructs were engineered to be used as models for: i) healthy contractile myocardial tissue, which can be potentially used to generate in vitro screening model systems, as well as to study the fundamental mechanisms of myocardial biology; ii) diseased myocardial scar-like tissue, which would permit to better understand the process that leads to the scar formation after a myocardial infarction and to test the efficacy of drug candidates and new therapies. In particular, contractile cardiac 3D constructs were engineered by embedding neonatal rat ventricular cardiomyocytes in a fibrin gel and culturing them for 6 days into the microfluidic device, in the presence and absence of cyclic mechanical stimulation. The effect of cyclic mechanical stimulation on cell survival was assessed through LIVE/DEAD assay; morphology, organization, construct maturation and formation of synergic structures were assessed through optical microscopy and immunofluorescence. To engineer cardiac scar-like microtissues, cardiac fibroblasts were embedded in fibrin gel and cultured for 7 days into the microfluidic devices; cells were statically and dynamically cultured, with or without the addition of a specific biochemical cue: transfroming growth factor beta 1 (TGF-β1). Previous studies already demonstrated that TGFβ1 supplementation in 2D cultures or at the macroscale, also in combination with the application of constant mechanical tension, is able to enhance the switch of phenotype from fibroblasts to myofibroblasts, which play a key role in wound healing and fibrosis. Based on these studies, we hypothesized that the application of a cyclic mechanical stretch, as well as the addition of TGFβ1 to the culture medium, would increase this phenotype transition. The effect of the different culture conditions on cell phenotype, proliferation and ECM stiffness were investigated through optical microscopy, immunofluorescence and atomic force microscopy (AFM).

Il presente lavoro di tesi ha riguardato la progettazione e realizzazione di un dispositivo microfluidico multistrato, dotato di due compartimenti: uno superiore, per la coltura cellulare di costrutti cellulari tridimensionali, e uno inferiore, utilizzato per fornire la stimolazione meccanica. Le fasi di progettazione e sviluppo del sistema microfluidico e l’implementazione del sistema di attuazione meccanica sono state svolte presso il laboratorio di Micro e Biofluidodinamica (μBS Lab) del Dipartimento di Bioingegneria del Politecnico di Milano. La piattaforma microfluidica è stata poi validata biologicamente presso il Cardiac Surgery and Engineering (CSE) Group del Dipartimento di Biomedicina dell’Ospedale Universitario di Basilea (Svizzera). In particolare, durante la validazione biologica del sistema, sono stati generati costrutti tridimensionali alla microscala da utilizzare nell’ambito dell’ingegneria del tessuto cardiaco come modello per: i) tessuto cardiaco funzionale, nell’ottica di utilizzare in futuro tale modello per screening in vitro di farmaci, oppure per studiare i meccanismi di base della biologia del miocardio; ii) tessuto cardiaco cicatriziale, che si ingenera patologicamente dopo un infarto, per meglio comprendere i processi che portano alla generazione della fibrosi e, ancora una volta, come screening per valutare l’efficacia di trattamenti farmacologici e di nuove terapie. Più in dettaglio, i costrutti cardiaci, ottenuti per intrappolamento di cardiomiociti ventricolari neonatali di ratto in un gel di fibrina, sono stati coltivati sia in presenza sia in assenza di stimolazione meccanica ciclica, valutandone gli effetti su morfologia, organizzazione e maturazione tissutale, nonché sulla formazione di strutture sinergiche. A tale fine sono state utilizzate tecniche di microscopia ottica e a fluorescenza. Per quanto riguarda la modellizzazione del tessuto cicatriziale, sono stati generati costrutti tridimensionali di fibroblasti cardiaci in gel di fibrina. Tali costrutti sono stati coltivati staticamente e dinamicamente, in presenza e assenza di uno specifico stimolo biochimico: il transfroming growth factor beta 1 (TGF-β1). Come mostrato in studi precedenti in colture bidimensionali o alla macroscala, la somministrazione di TGF-β1, anche in combinazione con l’applicazione di una tensione costante, induce la trasformazione dei fibroblasti in miofibroblasti, che in generale giocano un ruolo fondamentale nel wound healing e nella fibrosi. Su questa base, è stato ipotizzato che l’applicazione della stimolazione meccanica ciclica in combinazione con la supplementazione di TGF-β1 fosse in grado di incrementare tale processo di trasformazione. L’effetto della stimolazione meccanica ciclica e biochimica sul fenotipo e la proliferazione cellulare è stato investigato utilizzando tecniche di microscopia ottica e a fluorescenza. Inoltre, la stiffness della matrice extracellulare prodotta da tali costrutti è stata investigata tramite microindentazione, usando microscopia a forza atomica.