Bioprinting of three-dimensional fibrous scaffolds for cardiac tissue engineering

Current therapeutic strategies to restore the function of an injured tissue or organ involve the transplant from a donor and, if possible, the implantation of a medical device. However, these solutions possess intrinsic limitations in terms of availability, rejection due to immune incompatibility, and effective restoration of the original biological functions. In this scenario, Tissue Engineering (TE) aims to synthesize bio-artificial surrogates in vitro in order to regenerate the damaged tissue or organ rather than replace it. TE usually combines three key components, i.e. cells, scaffolds and growth-stimulating factors (GFs). Scaffold micro-architecture defines the three-dimensional (3D) space for cell maturation and influence cell colonization, adhesion, proliferation and functionality. Conventional methods for scaffold fabrication offer little capacity to precisely control the microstructure of the scaffold. In contrast, Rapid Prototyping (RP) is a manufacturing technique that combined with TE allows to produce scaffolds with well-defined internal architecture. A promising application of RP in TE is represented by bioprinting, which consists in the simultaneous deposition of living cells, supporting biomaterials (mainly hydrogels) and GFs, with spatial control over their 3D arrangement. The main aim of this thesis is to use a hydrogel based RP technique (based on a coaxial extruder and a two steps crosslinking) to produce cell-laden scaffolds for cardiac TE and induce their maturation through a custom-made microfluidic bioreactor, which provides hydrodynamic and electrical stimulation. Scaffold with high fidelity of reproduction of the desired fiber patterns have been obtained and tested for cell-culture applications. Hydrogel fibers acted as a geometrical template for the spreading of embedded Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs), that are induced to form a pre-designed vasculature-network precursor. The 3D pre-vascular network was used as a scaffold for the subsequent seeding of a second cell type, specifically Neonatal Rat Cardiomyocytes. The architecture of the scaffold was controlled by varying the spacing between the fibers, in order to make the 3D construct structurally compatible with recapitulating the anisotropy of the cardiac tissue. Anisotropic constructs have shown to promote the formation of grafts with highly aligned cardiomyocytes, when compared with the isotropic control. Finally, a microfluidic bioreactor was designed, optimized and fabricated in order to house the seeded 3D-printed scaffold, improve mass transfer and provide tailored stimuli to cells (i.e. electrical and hydrodynamic stimulation).

Le attuali strategie terapeutiche volte al rispristino della funzione di un tessuto od un organo danneggiato prevedono il trapianto da un donatore e, se possibile, l'impianto di un dispositivo biomedico. Tuttavia, tali soluzioni possiedono intrinseche limitazioni in termini di disponibilità, compatibilità immunologica ed effettivo ripristino dell'originaria funzione biologica. In questo scenario, l'ingegneria tissutale ambisce a sintetizzare surrogati bio-artificiali in vitro con lo scopo di rigenerare un tessuto od un organo danneggiato piuttosto che sostituirlo. Solitamente, l'ingegneria dei tessuti si basa sulla combinazione di tre componenti chiave, i.e. cellule, scaffolds e fattori di crescita. La micro architettura dello scaffold definisce lo spazio tridimensionale in cui le cellule hanno la possibilità di maturare e influenza la colonizzazione, adesione, proliferazione e funzionalità cellulare. I metodi convenzionali per la fabbricazione degli scaffolds offrono una limitata capacità di controllare con precisione le micro struttura dello scaffold. Al contrario, la prototipazione rapida è una tecnica di fabbricazione che, in combinazione con l'ingegneria dei tessuti, permette di produrre scaffolds con un’architettura interna definita a priori. Una promettente applicazione della prototipazione rapida nel campo dell'ingegneria dei tessuti è rappresentata dal bioprinting. Quest'ultimo consiste nella deposizione simultanea di cellule, biomateriali di supporto (principalmente idrogeli) e fattori di crescita, con pieno controllo sulla loro disposizione tridimensionale. Lo scopo di questo progetto di tesi è quello di utilizzare una tecnica di prototipazione rapida (basata su un estrusore coassiale e un doppio step di gelificazione) per produrre scaffolds fibrosi per applicazioni nel campo dell'ingegneria tissutale cardiaca e indurre la loro maturazione mediante l'utilizzo di un bioreattore microfluidicio in grado di fornire stimoli idrodinamici ed elettrici. Scaffolds altamente riproducibili sono stati fabbricati e testati per applicazioni cellulari. La struttura fibrosa dello scaffold ha dimostrato di agire come template geometrico per lo spreading di cellule endoteliali estratte da vena di cordone ombelicale umano (HUVECs) incorporate nell'idrogelo, inducendole a formare una primordiale rete vascolare progettata a priori. I costrutti sono stati utilizzati come scaffolds per la successiva semina di un secondo tipo cellulare, nello specifico cardiomiociti neonatali di ratto. L’architettura interna dello scaffold è stata controllata variando la distanza tra la fibre, con lo scopo di riprodurre la natura anisotropica del tessuto cardiaco ed indurre l'allineamento dei cardiomiociti. Quest’ultimo è risultato tanto migliore quanto maggiore fosse l'anisotropia dello scaffold. Infine, un bioreattore microfluidico è stato progettato, ottimizzato e fabbricato per perfondere gli scaffolds seminati con cellule cardiache, migliorare gli scambi di massa e per fornire stimoli personalizzati alle cellule (i.e. stimolazione elettrica).