Development of protocol for the determination of exofacial thiolated proteins in Hela cells

Proteins are the driving force for all cellular processes, able to regulate several cellular reactions through binding different partners such as proteins, peptides, DNA and also RNA. These interactions are essential in the regulation of cell homeostasis and they could be also important in drugs development and gene therapy. In particular, thiolated exofacial proteins play a role in endocytosis of thiol-functionalized nanoparticles used as gene or drug vectors. The aim of this thesis project is to develop a new experimental protocol (Fig. 1) able to identify these thiolated proteins. Their identification via mass analysis will lead an improvement in transfection processes through control of protein corona formation. To achieve this purpose Silica paramagnetic thiolated nanoparticles have been chosen to simulate the surface of functionalized drug and gene vectors. The research started with the establishment of a suitable interaction protocol between HeLa cells and thiolated beads. First of all, the kinetic of disulfide bridge formation have been studied exploiting the fluorescent signal of a secondary antibody containing thiols on its surface. Once the antibody has interacted with thiolated beads, a difference signal was measured at different time points, important to evaluate the suitable incubation time for next interaction experiments. Then, the quantity of thiols, present on HeLa cells surface and onto beads surface, have been tested by Ellman’s assay in order to understand the right quantity of free thiols to put in contact. The interaction protocol was characterized by an incubation time of 10 minutes with 2 minutes of bubbling, necessary to promote disulfide bridge formation. Then cells have undergone freeze-thaw lysis and the intracellular components have been removed by PBS washing steps. The recovery of exofacial thiolated proteins has been performed by incubation of reducing agent DTT, able to break the disulfide bonds. Extracted proteins were dialyzed using a proper cassette and they were identified by Mass Spectrometry after a previuos separation by SDS-PAGE. Data analysis, elaborated by Mascot software using both Uniprot_HeLa and Uniprot_HomoSapiens databases, have shown a remarkable enrichment of membrane proteins after treatment with magnetic thiolated beads. Certainly the data need future confirmation and validation, but they could be considered as an interesting starting point to investigate the role of membrane proteins in the biocompatibility of nanomaterials used for drug delivery.

Le proteine sono il motore trainante che regola i diversi processi vitali nei vari compartimenti cellulari. Le interazioni con altre proteine, peptidi, DNA e RNA sono essenziali nella regolazione delle funzioni cellulari e possono essere ottimizzate per lo sviluppo di farmaci e della terapia genica. In particolare, le proteine tiolate di membrana presentano un ruolo significativo nel facilitare l’endocitosi di nanoparticelle, funzionalizzate con tioli, adoperate come vettori di gene e drug delivery. L'obiettivo di questa tesi è lo sviluppo di un nuovo protocollo sperimentale (Fig. 1) in grado di identificare tali proteine tiolate al fine di migliorare i processi di trasfezione mediante il controllo della formazione del protein corona sulla superficie dei carrier d’interesse. Si è scelto di simulare la superficie di tali trasportatori con nano particelle in silice paramagnetiche caratterizzate da tioli liberi sulla superficie. Il progetto è iniziato con lo sviluppo di un protocollo di interazione, tra le cellule HeLa e le nano particelle, atto alla cattura delle proteine tiolate superficiali. In primo luogo è stata studiata la cinetica di formazione dei ponti disolfuro tramite l’utilizzo di un anticorpo secondario che presentava tioli sulla propria superficie. La differenza di segnale fluorescente, emesso dall’anticorpo una volta avvenuta l’interazione con le nano particelle, ha permesso una stima delle tempistiche di formazione dei ponti disolfuro e, quindi, dei tempi di incubazione da scegliere nei successivi esperimenti. In seguito è stata eseguita una misurazione dei tioli presenti sulla superficie sia delle cellule HeLa e sia delle nano particelle magnetiche tramite Ellman test, per capire la quantità esatta di tioli da mettere in contatto. Al termine di questa prima fase di ottimizzazione delle condizioni sperimentali, il protocollo di interazione prevedeva un tempo di incubazione pari a 10 minuti, con 2 minuti di gorgogliamento di ossigeno per promuovere la formazione dei ponti disolfuro. Le cellule sono state successivamente lisate tramite cicli di congelamento e scongelamento con azoto liquido e la parte intracellulare è stata rimossa dai campioni tramite lavaggi con PBS. Una successiva incubazione con il riducente DTT ha permesso il recupero delle proteine tiolate di membrana legate alle nano particelle. I campioni sono stati in seguito sottoposti a dialisi in cassetta dializzante, per rimuovere il DTT residuo, e le proteine estratte dalle particelle sono state analizzate tramite SDS-PAGE e spettrometria di massa. L'analisi dei dati dei campioni, eseguita mediante sofware Mascot utilizzando le banche dati Uniprot_HeLa e Uniprot_HomoSapiens , ha dimostrato un arricchimento di proteine di membrana in seguito al trattamento con le nano particelle magnetiche tiolate. Certamente i risultati ottenuti necessitano di ulteriori conferme e validazioni, ma rappresentano un interessante punto di partenza per investigare il ruolo delle proteine di membrana sulla biocompatibilità delle nano particelle utilizzate in ambito di drug delivery.