Evaluation of stability of polymer/DNA carrier systems in serum and their biochemical efficacy

It is known that many human diseases are ascribable to alteration or absence of proteins synthetized by cells. In the 1970s new methods and approaches to treat diseases were explored; it was discovered that an exogenous gene can modify the biology and phenotype of target cells, to correct a great number of pathologies. This opened the doors to gene therapy, which is described as the introduction of genetic material into cells to modify or control their protein expression. It is an approach that acts on the causes of diseases rather than on their symptoms. The methodologies exploited to perform gene therapy allow the replacement of a mutated gene with a healthy copy, the inactivation of the mutated gene and the introduction of a new genetic sequence. However, despite the promising clinical advancements, gene delivery is still in the phase of clinical trials. Gene therapy needs two main actors to achieve its aim: a specific sequence of nucleic acids and an effective and safe delivery system; the combination of both of them can lead to a performing gene delivery system. The delivery vectors should be able to: protect the nucleic acids against degradation by biological environment, promote internalization of the genetic material into the target cells and its administration should not have detrimental effects. At the beginning, researchers focused on viral carriers to achieve gene delivery, but this class of vehicles, despite their high transfection efficiency, is toxic, immunogenic and not safe for the receiving organisms. For these reasons, investigations in non-viral alternatives were explored. Cationic lipids and polymers are cheaper, more stable and safer substitutes. Unfortunately, they show lower transfection efficiency. In particular, cationic compounds are widely used because nucleic acids, containing negatively charged phosphates, bind electrostatically them, in a spontaneous electrostatic interaction that lead to the formation of complexes. At this purpose, this thesis work is focused on the study, from the biochemical and physical-chemical point of view, of complexes formed by a cationic polymer (polyethylenimine - PEI) and DNA, also called polyplexes. PEI/DNA complexes are considered a gold standard among non-viral vectors. These polymers exist in two forms: linear and branched. Linear PEI (lPEI) is composed almost exclusively by secondary amines. Instead, its branched counterpart (bPEI) contains primary, secondary and tertiary amines. PEI utilized had a molecular weight of 25kDa and they were prepared in 150mM NaCl, to achieve N/P 30 (number of Nitrogens of cationic polymer with respect to the number of Phosphates of DNA). PEI can buffer a large range of pH, thanks to the protonation of its amines. In biological environment, only 20% of PEI amines is protonated and this permit to increase its protonation state when pH decreases after endocytosis. The protonation gives the polymer a positive charge, allowing the binding with negatively charged DNA and interaction with anionic cell membrane, these facts are fundamental to enter the cell. The structural differences between the two polymers are important because affecting their toxicity and their transfection ability. PEI/DNA complexes enter the cell mainly through a mechanism called “endocytosis”: after the internalization through cell membrane, polyplexes are incorporated in an endocytic vesicle. This vesicle is acidified thanks to membrane proton-pumps, becoming an endosome that at the end of the intracellular path fuses to a lysosome. Polyplexes need to escape the vesicle before being degraded and this happens thanks to the so call “proton sponge” effect, that derives from the buffering capability of PEI. Polyplexes succeed in escaping the lysosome by promoting its swelling and inhibiting the lysosome nuclease activity. Free DNA remains in cytosol as long as cell replicates, when a real nucleus is no more present and exogenous DNA can enter it. Despite polyplexes were widely investigated for gene therapy purposes, little is known about their behavior in biological environments. Characterization was done in plain solvents, but to understand their biological activity it is essential to study their behaviors in presence of macromolecules of biological fluids. In fact, biomolecules, mainly proteins, interact spontaneously with polyplexes: they can be absorbed on their surface giving new surface properties, influencing their stability and interplay with cellular machineries. Based on the scientific literature, two behaviors can be hypothesized for polyplexes once suspended in serum-supplemented culture medium: complexes can adsorb proteins electrostatically, leading to the formation of a “protein corona” or undergo disassembly. These different outcomes influence their biochemical behavior, especially with regards to their transfection efficiency and cytotoxicity. Serum can inhibit both the electrostatic interactions between cationic polymers and cell membrane, decreasing their transfection capability and, on the contrary, enhance transfection efficiency, promoting specific interaction between absorbed proteins on the surface of polyplexes and membrane receptors. Unfortunately, it is not possible to predict a standard behavior, because a great number of factors can modulate bio-nano interactions. Hereafter is a short synthesis of the methods and materials used in this work. Physical-chemical characterization was obtained thanks to DLS measurements (Dynamic Light Scattering). Instruments utilized are ALV CGS-3 compact goniometer system and Zetasizer Nano ZS. These instruments exploit cumulant method and CONTIN algorithm to determinate the hydrodynamic radius of particles in suspension. The surface potential of complexes (ζ-potential) was measured with a specific tool of Zetasizer Nano ZS. 1D/SDS-PAGE gel electrophoresis was used to detect the proteins adsorbed on the surface of the samples. The biochemical characterization, implemented thanks to in vitro transfections on HeLa cell line, allowed the evaluation of the effectiveness of gene delivery systems in terms of cell viability and transfection efficiency. In the first part of the work a structural study on polyplexes was carried out. Preliminary studies concerning with the dimensional stability of polyplexes evaluated over time was performed, to determinate the appropriate complexation time that was set to 20 minutes. After that, a comparison between lPEI/ and bPEI/DNA complexes was conducted. From these analyses, resulted that the two kinds of polyplexes were different already before incubation in medium: lPEI polyplexes showed higher values of hydrodynamic radius, while bPEI/DNA complexes were characterized by smaller diameters but showed higher ζ-potential. Dilution tests were performed to analyze the stability of polyplexes after their dilution in different solutions (NaCl 150mM and water). Size changes were monitored, but no significant modifications were detected; only bPEI/DNA complexes diluted in water underwent a slight increase in their diameter. Since physical-chemical characterization and transfection experiments were done with two different DNA sources, a comparison between the complexes formed with both DNAs was carried out to assure that complexes were similar. DLS analysis confirmed that PEI/DNA complexes obtained with the two DNAs had similar properties, so the results obtained from their characterization and transfection could be compared. Afterwards, lPEI and bPEI polyplexes were incubated in increasing concentrations of serum-supplemented cell culture medium (serum free, 1%, 2.5%, 5%, 10% and 50% v/v of serum with respect to the total volume of cell culture medium). The effect of serum on PEI/DNA complexes was investigated via DLS and through transfection experiments. Significant differences were revealed comparing the two polyplexes incubated in the same conditions: lPEI/DNA complexes showed a constant decrease of hydrodynamic radius from starting values as increasing the concentration of serum in medium, while bPEI complexes were characterized by an increase of diameter when incubated in serum, except for very high concentrations. This could be explained with the partial disassembly of lPEI complexes, while bPEI complexes appeared to form larger and probably more stable structures. After the structural characterization, transfection experiments with transfectant polyplexes at increasing concentrations of serum in culture medium were performed. Higher concentration of serum led to an enhancement of cell viability and a decreased transfection efficiency. This decrease of efficiency could be ascribable to the fact that high concentration of serum in cell culture medium promotes protein absorption on both cell membrane and polyplexes, disfavouring the interactions between them, leading to a reduction of the uptake of complexes. bPEI/DNA complexes showed higher values of transfection efficiency respect to lPEI/DNA polyplexes when dispersed in culture medium containing an FBS concentration going from 0% to 5%. In presence of higher concentration of serum, the two polyplexes showed similar biological outcome and were characterized by low transfection capabilities. The different behavior showed by lPEI and bPEI polyplexes in transfection experiments could be related to their different physical-chemical properties after the interaction with serum components. As demonstrated, while lPEI polyplexes are structurally unstable after their dispersion in culture medium, bPEI polyplexes can interact with surrounding proteins forming protein corona (PC) complexes able to efficiently transfect cells. Furthermore, transfection experiments were performed in order to assess the influence of preconditioning cells with high concentrated serum medium. Transfection efficiency and cytotoxicity after administration of both the polyplexes were evaluated and results were compared with a “standard” transfection. In this case, regardless of cell preconditioning, higher concentration of serum led to a decrease in the transfection efficiency. However, while transfection efficiency of bPEI polyplexes was not affected by cell preconditioning, preconditioned lPEI/DNA complexes showed decreased transfection capabilities respect to standard conditions. These experiments highlighted again the different behavior of lPEI/ and bPEI/DNA complexes when placed in a biological environment. One explanation to these differences could be related to the internalization pathway of complexes or to their different interaction with cell membrane. According to this, bPEI/DNA complexes seem to be internalized by endocytosis, while lPEI/DNA complexes seem to follow also an alternative internalization pathway. The second part of the work was focused on the isolation and purification, via dialysis and centrifugation, of polyplex-protein complexes from the excess of serum proteins. This allowed to study and to understand how polyplex structure is influenced by the surrounded biological environment. Complexes were firstly incubated in DMEM with 10% of FBS to allow their interaction with proteins, then they were submitted to isolation processes. In first attempt, dialysis of polyplexes incubated in DMEM was performed systematically changing dialysis solvents, times and volumes of dialysate in order to achieve the best conditions suitable for the isolation of the potential polyplex-PC complexes. In the optimized process, NaCl 150mM was chosen as the best solvent, dialysis time was set to 48 hours, while experiments were carried out at 4°C. Dialysis process led to purification from the protein excess both for lPEI/ and bPEI/DNA, as tested by DLS and SDS-PAGE. While lPEI and DMEM samples after dialysis were characterized by the same protein content, bPEI samples appeared to be characterized by a protein enrichment, confirming the hypothesis of the formation of a protein corona on it. For what concerns dimension of dialyzed polyplexes, lPEI/DNA complexes showed an increased radius respect to the one measured in presence of serum, even though they were still smaller with respect to starting ones (lPEI/DNA polyplexes obtained after complexation), while bPEI polyplex radius became larger respect to its starting point. Dialysis process was also carried out using DMEM without serum as dialysis buffer, permitting to achieve purified complexes in medium suitable for transfection. Though this technique allowed a good isolation of the polyplexes, a negligible transfection efficiency of the recovered samples was found. This can be connected to a potential rearrangement of polyplexes driven by their interaction with proteins during the course of the dialysis process. After the challenging results obtained with dialysis purification, isolation via centrifugation was attempted. PEI/DNA complexes incubated in serum-supplemented medium were centrifuged to separate polyplexes from the solvent and excess of proteins. Protocol was improved testing different concentrations of polyplexes in transfection solution, to obtain the maximum amount of material that allowed to better appreciate enrichment of proteins on the complexes. Similarly to the results obtained for dialyzed samples, after purification, lPEI/DNA complexes were characterized by smaller hydrodynamic radius respect to the one measured before the dilution in serum-supplemented DMEM. Conversely, bPEI polyplexes were bigger respect to their initial conditions. SDS-PAGE gel electrophoresis was also performed on purified samples, confirming a major retention of proteins by bPEI/DNA complexes respect to lPEI polyplexes. These results hint to a partial disassembly of lPEI/DNA complexes and the formation of larger particles with associated protein corona for bPEI/DNA complexes. Transfection experiments with centrifuged samples and their supernatants were performed in order to evaluate the efficiency of the purification process and to verify the transfection capabilities of polyplexes that had interacted with proteins. Samples were incubated in DMEM 10% FBS and in serum-free DMEM, then recovered by the same protocol of centrifugation used for chemical-physical characterization. Purified polyplexes were then used in transfection experiments. In this case both transfected and control cells were cultured in serum-free DMEM and they showed lower viability with respect to their correspondents cultured in DMEM 10% FBS. In the case of cells treated with centrifuged samples, they had similar viability, regardless of the medium of pre-incubation and the number of centrifugation/resuspension cycles used for purifying complexes. Analyzing transfection efficiencies, values were lower when purified samples were incubated with cells in serum-free conditions, since the absence of proteins disfavors the recovery of the pellet. Independently from the concentration of serum and the cycles of purification, lPEI/DNA complexes were characterized by lower values of transfection efficiency respect to bPEI/DNA samples confirming the lower stability of this kind of polyplexes. This phenomenon could be related to a stabilizing effect due to the interaction between bPEI polyplexes and proteins that permitted them to be more stable and to not disassemble, as happens for lPEI/DNA complexes dispersed in culture medium. For bPEI/DNA polyplexes, after the first cycle of purification complexes were equally distributed in the resuspended pellet and in the supernatant, while after the last resuspension they were only presented in the supernatant. In this case, the sum of transfection efficiencies obtained after the administration to cells alternatively of the supernatants or resuspended pellets, was similar to the one measured for control samples, indicating that, very likely, transfection potential and structure of purified bPEI/DNA remained unaltered. In contrast to dialysis that changed polyplex structure, hampering their delivering ability, centrifugation allowed to obtain purified polyplex-protein complexes able to transfect with an efficiency just below the one measured in standard conditions. This is particularly true for bPEI/DNA complexes. One of the major technical limits of this purification process, together with its reduced repeatability, was the inability to quantitative evaluate the presence of polyplexes in the purified pellets or in the supernatants. Despite centrifugation gives interesting information about the physical-chemical structure of purified polyplexes, to get a real picture of the in situ polyplex-PC interaction with cells ad hoc quantitative purification strategy should be pursued. Further studies in this direction must be done in order to find alternatives for the isolation of polyplex-protein complexes. This method should be able to permit polyplexes physical-chemical characterization without damaging them and without modifying their equilibrium, that may cause structural changes of the system.

La gene therapy è un potente approccio terapeutico che si basa sulla possibilità di trasferire sequenze di DNA all’interno di una cellula. Il fine è quello di curare diverse tipologie di malattie umane, per lo più causate dall’alterazione genica o dall’assenza di proteine sintetizzate in maniera autogena a livello cellulare. Mirando ad intervenire sulle cause piuttosto che i sintomi della malattia, la gene therapy è molto spesso considerata la terapia del futuro. Essa, infatti, permette di inattivare o sostituire un gene mutato con una copia sana oppure di introdurre una nuova sequenza genica laddove necessario. Attualmente, però, nonostante i promettenti successi clinici, i rischi connessi al suo utilizzo non hanno permesso l’approvazione per la vendita dei trattamenti di terapia genica finalizzati all’applicazione sull’uomo. Per una soddisfacente risposta terapeutica è necessario un sicuro ed efficace sistema di rilascio, definito vettore o delivery system, in grado di proteggere la sequenza di acidi nucleici dalla degradazione causata dall’ambiente biologico e di promuoverne l’internalizzazione nelle cellule. I vettori comunemente utilizzati in terapia genica sono principalmente di due tipi: virali e non virali. I primi sono caratterizzati da un’ottima efficienza di trasfezione ma comportano seri problemi di immunogenicità e mutagenicità, che ne limitano l’applicabilità nei trials clinici. Lipidi e polimeri cationici, per via della loro sicurezza e versatilità, rappresentano un’alternativa valida e sicura all’utilizzo di virus, nonostante la minore efficienza di trasfezione. I composti cationici sono in grado di formare legami elettrostatici con gli acidi nucleici, contenenti gruppi carichi negativamente, dando origine alla formazione di complessi. I complessi sono definiti rispettivamente lipoplessi o poliplessi a seconda che il DNA interagisca con lipidi o polimeri. Il presente lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio, dal punto di vista biochimico e chimico-fisico, di poliplessi formati da un polimero cationico (polietilenimmina - PEI) e DNA, essendo questi riconosciuti come gold standard tra i sistemi non virali. Questo polimero esiste sia in forma lineare che ramificata. La forma lineare (lPEI) contiene quasi esclusivamente ammine secondarie. Il PEI ramificato (bPEI), invece, è caratterizzato dalla presenza di ammine primarie, secondarie e terziarie. In particolare i PEI utilizzati in questo lavoro hanno peso molecolare di 25kDa e sono stati preparati in soluzione di NaCl 150mM con un rapporto tra gli atomi di azoto del polimero ed il numero di atomi di fosforo del DNA (N/P) di 30. Una caratteristica fondamentale che rende il PEI una valida alternativa in terapia genica è la sua capacità tampone, derivante dalla possibilità di protonare in ambiente biologico le ammine che lo compongono. Questa peculiarità conferisce al polimero una carica positiva, fondamentale nell’interazione sia con il DNA che con la membrana cellulare, entrambi carichi negativamente. Le proprietà tampone del PEI sono inoltre alla base del cosiddetto “proton sponge effect” che garantisce la fuoriuscita del complesso PEI/DNA dalla vescicola endo-lisosomale nel quale è stato incorporato durante il processo di internalizzazione cellulare. A seguito della lisi vescicolare, il DNA viene rilasciato nel citosol, in attesa di essere integrato all’interno del nucleo cellulare durante il processo di duplicazione cellulare, per poi essere processato. Nonostante i poliplessi siano stati ampiamente studiati come vettori per la gene therapy, attualmente sono poche le certezze riguardo al loro comportamento in ambiente biologico. L’adsorbimento proteico sulla superficie dei poliplessi, risultante dall’incubazione in mezzo di coltura contenente siero, in alcuni casi può portare alla formazione di una “protein corona” (PC) e in altri casi al disassemblaggio del complesso stesso. La stessa ambiguità di comportamento si ritrova anche analizzando l’influenza del siero sull’efficienza di trasfezione di questi poliplessi. Alcuni studi, infatti, identificano nel siero un’importante barriera per la trasfezione, mentre altri ne esaltano le potenzialità, riconoscendolo come il primo responsabile dell’interazione, mediata da proteine, tra complessi e membrana cellulare. A questo proposito, il presente lavoro di tesi si è posto l’obbiettivo di caratterizzare dal punto vista biochimico e chimico-fisico i complessi PEI/DNA a seguito dall’interazione con le macromolecole, per lo più proteine, presenti nel siero. Di seguito è riportata una breve sintesi dei metodi e dei materiali utilizzati in questo lavoro. La caratterizzazione chimica-fisico è stata ottenuta grazie a misure effettuate al DLS (Dynamic Light Scattering). Gli strumenti utilizzati sono stati ALV CGS-3 compact goniometer system e Zetasizer Nano ZS. Entrambi si servono del metodo dei cumulanti e dell’algoritmo CONTIN per determinare il raggio idrodinamico di particelle in sospensione. La carica superficiale dei complessi (ζ-potential) è invece stata misurata grazie ad una specifica applicazione dello strumento Zetasizer Nano ZS. L’utilizzo della gel elettroforesi 1D/SDS-PAGE ha permesso di rilevare la presenza di proteine adsorbite sulla superficie dei campioni una volta purificati dall’eccesso proteico. Infine, la caratterizzazione biochimica, eseguita grazie alle trasfezioni in vivo sulla linea cellulare HeLa, ha permesso di valutare l’efficacia dei sistemi di gene delivery considerandone gli effetti sia sulla vitalità cellulare che sull’efficienza di trasfezione. La prima parte del lavoro di tesi si è concentrata sull’analisi strutturale dei poliplessi. A questo proposito, è stata condotta una serie di studi preliminari al fine di valutare la stabilità dimensionale dei poliplessi nel tempo e di definire il tempo ottimale di complessazione per i poliplessi analizzati. Il confronto tra i complessi lPEI/ e bPEI/DNA ne ha invece messo in mostra le differenze chimico-fisiche, rilevabili già prima dell’incubazione nel terreno di coltura. I poliplessi formati con lPEI, infatti, risultano avere maggiori valori di raggio idrodinamico, mentre i complessi con PEI ramificato hanno evidenziato valori superiori di ζ-potential. La stabilità dei due sistemi, investigata tramite diluizione dei complessi in NaCl e acqua, non ha rilevato alcuna variazione dimensionale dei complessi correlabile al processo di diluizione stesso. Poiché la caratterizzazione fisico-chimica e gli esperimenti di trasfezione sono stati effettuati utilizzando due DNA differenti, un confronto tra i complessi formati da entrambi i tipi di DNA è stato effettuato per escludere eventuali differenze di comportamento, che ostacolerebbero il confronto tra risultati ottenuti nelle diverse condizioni sperimentali. Successivamente, i poliplessi formati con lPEI e bPEI sono stati incubati in terreni di coltura contenenti concentrazioni crescenti di siero (senza siero, 1%, 2.5%, 5%, 10% and 50% v/v di siero rispetto al volume totale) e successivamente caratterizzati tramite analisi al DLS ed esperimenti di trasfezione, per studiare la dipendenza delle loro caratteristiche chimico-fisiche in funzione del quantitativo di siero. Differenze significative sono state rilevate comparando i due differenti tipi di poliplessi incubati nelle stesse condizioni: i complessi lPEI/DNA hanno mostrato une netta diminuzione delle loro dimensioni in seguito alla dispersione in terreno addizionato a siero, mentre per i complessi bPEI/DNA è stato rilevato un incremento del diametro idrodinamico se incubati in concentrazioni di siero inferiori al 50%. Questi risultati possono essere spiegati ipotizzando un parziale disassemblaggio in terreno addizionato a siero dei complessi lPEI/DNA mentre i poliplessi preparati con il bPEI sembrano formare strutture più grandi e probabilmente più stabili. Gli esperimenti di trasfezione, realizzati con poliplessi incubati in terreni di coltura con concentrazioni crescenti di siero, hanno evidenziato come alte concentrazioni di siero determinino un aumento della vitalità cellulare, associato però ad una diminuzione dell’efficienza di trasfezione. Questo fenomeno sembra essere associabile all’adsorbimento proteico, che segue l’incubazione in presenza di siero, sia sulla membrana cellulare che sui poliplessi, che induce una riduzione dell’endocitosi dei complessi stessi, limitandone le interazioni. Inoltre, i complessi bPEI/DNA hanno mostrato efficienza di trasfezione maggiore rispetto ai poliplessi con lPEI quando diluiti in terreni di coltura deprivati o contenenti concentrazioni di FBS dallo 1% al 5%. In presenza di concentrazioni maggiori di siero, invece, entrambe le tipologie di poliplessi sono risultate essere caratterizzate da scarse capacità trasfettanti. Il differente comportamento esibito dai poliplessi formati con lPEI e bPEI negli esperimenti di trasfezione potrebbe essere legato alle diverse proprietà fisico-chimiche, risultanti dall’incubazione in DMEM con FBS. Infatti, l’interazione con il siero nel caso dei poliplessi con lPEI ne ha evidenziato l’instabilità strutturale, mentre per i complessi bPEI/DNA ha messo in mostra l’interazione con le proteine circostanti, responsabili della formazione di quella che generalmente viene definita PC. Ulteriori esperimenti di trasfezione sono stati realizzati con l’intento di definire l’effetto del pre-condizionamento cellulare con mezzo di coltura contenente alte concentrazioni di siero (50% v/v volume di siero in volume totale di mezzo di coltura) sulle capacità trasfettanti dei poliplessi. Anche in questo caso, indipendentemente dal pre-condizionamento delle cellule, le alte concentrazioni di siero hanno determinato una riduzione dell’efficienza di trasfezione per tutti i campioni. Si è però notato che, mentre l’efficienza di trasfezione dei poliplessi con bPEI non viene influenzata dal pre-condizionamento, i complessi lPEI/DNA pre-condizionati mostrano minori capacità trasfettanti rispetto alle condizioni standard. Ciò potrebbe essere legato a differenti modalità di internalizzazione dei complessi. Infatti, sulla base dei risultati ottenuti e dai dati presenti in letteratura, sembra plausibile ipotizzare che i complessi bPEI/DNA vengano internalizzati dalle cellule prevalentemente tramite endocitosi mentre i poliplessi con lPEI seguano anche percorsi alternativi. La seconda parte del lavoro si è focalizzata sulla purificazione, tramite dialisi e centrifugazione, dei poliplessi dall’eccesso di proteine presenti nel siero, al fine di studiare le caratteristiche chimico-fisiche assunte a seguito dell‘interazione con le proteine presenti nel mezzo in cui sono stati dispersi. A questo proposito, i complessi sono stati dapprima incubati in DMEM contenente siero, per permetterne l’interazione con le proteine, per essere successivamente sottoposti ai protocolli di isolamento. Il primo metodo testato è stato la dialisi. Per ottenere le migliori condizioni possibili per l’isolamento dei complessi sono state effettuate delle prove preliminari variando i solventi, i tempi e i volumi di liquido dializzante. Il processo ottimizzato è caratterizzato dall’utilizzo di una soluzione di NaCl 150mM come buffer dializzante ed ha una durata di 48 ore con tre cambi mezzo a 18, 24 e 40 ore dall’inizio del processo di dialisi. Si è inoltre deciso di lavorare a 4°C, per limitare un eccessivo desorbimento proteico durante tutto il trattamento di purificazione. Il processo di dialisi ha portato ad una purificazione dell’eccesso proteico sia per i campioni lPEI/DNA che bPEI/DNA. L’analisi tramite gel elettroforesi, ha evidenziato un maggior contenuto proteico sui poliplessi realizzati con PEI ramificato, rispetto a quelli ottenuti con la variante lineare e al controllo, rappresentato da DMEM dializzato. L’analisi dimensionale effettuata sui poliplessi di lPEI dializzati ha evidenziato un aumento del raggio rispetto a quello misurato durante la prima ora di incubazione in presenza di siero, anche se esso si è mantenuto inferiore rispetto a quello ottenuto dai campioni iniziali (poliplessi misurati subito dopo la complessazione). Al contrario, i complessi bPEI/DNA dializzati sono risultati essere caratterizzati da un raggio idrodinamico maggiore rispetto a quello misurato sui campioni prima dell’incubazione in presenza di FBS. Questi risultati sembrano confermare l’ipotesi della formazione di una PC sui complessi realizzati con il bPEI, mentre sembrano suggerire l’idea di un parziale disassemblaggio dei complessi formati da lPEI. Il processo di dialisi è stato realizzato anche utilizzando DMEM come mezzo dializzante, così da ottenere complessi isolati dall’eccesso proteico e diluiti in terreno, adatti alla trasfezione. Nonostante questa tecnica abbia evidenziato la possibilità di ottenere un buon isolamento dei complessi dall’eccesso di proteine, la loro valutazione biochimica, investigata monitorandone l’abilità di trasfettare le cellule, ha rivelato risultati pressoché nulli. Questa evidenza sperimentale potrebbe essere legata alla sostituzione del DNA con le proteine nella formazione di un complesso con il PEI che avviene durante le 48 ore di dialisi. Visti gli scarsi risultati ottenuti dalla trasfezione con campioni purificati tramite dialisi si è deciso di testare l’isolamento tramite centrifugazione. Il protocollo di centrifugazione è stato ottimizzato testando concentrazioni di complessi e percentuali di siero maggiori rispetto a quelle normalmente utilizzate in trasfezione, al fine di facilitare il recupero del pellet derivante dalla purificazione dei complessi. Similmente a quanto ottenuto per la dialisi, i complessi lPEI/DNA sono risultati essere caratterizzati da raggi idrodinamici minori rispetto a quelli misurati per gli stessi campioni diluiti in presenza di siero. I poliplessi formati con il bPEI, invece, sono caratterizzati da dimensioni maggiori rispetto a quelle rilevate sui campioni nelle condizioni iniziali. La gel elettroforesi anche in questo caso ha confermato la presenza di una maggior quantità di proteine sui campioni con complessi di bPEI/DNA rispetto ai poliplessi formati con PEI lineare, confermando la presenza di una PC adsorbita sulla loro superficie. Gli esperimenti di trasfezione effettuati con i campioni centrifugati e i loro surnatanti sono stati eseguiti con l’intento di valutare le capacità trasfettanti dei poliplessi a valle dell’interazione con le proteine. A questo proposito, i campioni sono stati prima incubati in DMEM con 10% FBS o senza siero, per poi essere sottoposti al protocollo di centrifugazione. I poliplessi così purificati sono stati risospesi in terreno senza siero ed utilizzati per trasfettare le cellule. I campioni incubati senza siero hanno mostrato minor vitalità rispetto ai corrispondenti campioni in DMEM 10% FBS, ad eccezione dei campioni centrifugati, che hanno evidenziato simili valori di vitalità, indipendentemente dalla presenza o meno di siero durante l’ora di incubazione precedente al processo di isolamento e dal numero di cicli di centrifugazione/risospensione subiti. Questa evidenza potrebbe essere legata ad un limite intrinseco del processo di risospensione, che sembra influire negativamente sulla vitalità cellulare. Anche la diminuzione del contenuto proteico a seguito della purificazione, sembra muoversi nella stessa direzione. I campioni incubati in assenza di siero e poi centrifugati sono risultati essere caratterizzati da minor efficienza di trasfezione. Inoltre, l’assenza di proteine ha influenzato negativamente la formazione del pellet, determinando la progressiva perdita di campione durante i cicli di purificazione. Indipendentemente dalla concentrazione di siero presente nel terreno di incubazione, i complessi lPEI/DNA sono risultati essere caratterizzati da valori di efficienza di trasfezione più bassi rispetto alla rispettiva controparte preparata con il bPEI, confermando ancora una volta la minor stabilità di questi poliplessi. Probabilmente, infatti, la presenza di una PC adsorbita sulla superficie dei poliplessi preparati con il bPEI gli conferisce maggior stabilità, prevenendo il disassemblaggio che sembra caratterizzare invece i complessi lPEI/DNA. Analizzando nel dettaglio i poliplessi preparati con il bPEI si può notare come dopo il primo ciclo di centrifugazione/risospensione essi risultino equamente distribuiti nel pellet risospeso e nel surnatante, mentre dopo l’ultima rispospensione, essi si ritrovano solo nel surnatante. Nonostante ciò, la somma dell’efficienza di trasfezione ottenuta per i campioni trasfettati con il pellet risospeso e il surnatante ottenuto dal primo ciclo di centrifugazione/risospensione è risultata essere di poco inferiore a quella ottenuta dai campioni di controllo, evidenziando come la quantità e la struttura dei complessi purificati non vengano alterate dal processo di isolamento. Contrariamente alla dialisi, che ha portato ad una inefficiente trasfezione dei poliplessi isolati, la centrifugazione ha permesso, in alcuni casi, di ottenere complessi PEI/DNA purificati capaci di trasfettare con efficienza leggermente inferiore rispetto alla condizione standard. Allo stesso tempo, però, questi risultati hanno evidenziato i limiti della purificazione tramite centrifuga applicata ai poliplessi. Uno dei maggiori limiti di questo processo, insieme alla ridotta ripetibilità degli esperimenti, è l’impossibilità di valutare con certezza la presenza di poliplessi nel pellet risospeso o nel surnatante. Nonostante le interessanti informazioni ottenute relativamente alla struttura chimico-fisica dei complessi purificati, tutte queste limitazioni pratiche hanno evidenziato come la centrifugazione non possa essere considerata un buon metodo per isolare i poliplessi preparati con il PEI dall’eccesso proteico. Per tutti questi motivi, si ritiene necessario testare un differente metodo di purificazione per valutare in maniera più realistica le caratteristiche chimico-fisiche e biochimiche dei complessi risultanti dall’interazione con le proteine contenute nel siero.