Structure function relationship study of a new class of cationic lipid vectors

One of the main job of each cell is the synthesis of thousands of proteins, molecules that determine not only cell structure but also all its activities and functions. All cells belonging to the same human body contain identical genome but they act differently by expressing only the genes necessary for their incoming needs. Unfortunately, sometimes genetic mutations arise, leading to the production of abnormal proteins responsible of the onset of severe pathological conditions. Gene therapy gives the possibility to “correct” defective genes, responsible of the development of genetic disorders, by modifying and controlling the protein expression of target cells. Thanks to the application of this innovative therapy, nowadays experimentations are conducted not only on patients with genetic diseases but also on patients with several other diseases like cardiovascular diseases, cancer and so on. The limiting step of gene therapy is therefore the delivery of genetic material molecules to the affected cells (gene delivery) in order to modulate protein expression by over-expressing “healthy” proteins or by silencing the expression of “malignant” ones. The success of gene delivery is strongly affected by the use of a proper administration strategy. The direct administration of naked genetic material, without any carrier, into local tissues or into the systemic circulation, is probably the simplest and the safest approach but it results almost ineffective. To overcome the barriers which significantly hamper the efficiency of genetic material administration, many physical techniques have been developed. Despite the promising results obtained so far, the majority of them cannot be always used because the drawbacks often exceed the positive effects. For this reason, the development of a safer and optimized “carrier” for gene delivery is demanded. A vector can be defined as a carrier, responsible of the delivery and the internalization of the genetic material, that has to be protected until it reaches the destination where it should promote or inhibit the synthesis of the desired proteins. All the existing vectors belong basically to two classes: viral and non viral vectors. Viruses ability to infect a variety of mammalian cells suggested the possibility to use them as carriers. Obviously, before their use, they have to be engineered: their infectious ability has to be controlled while the target genetic material has to be insert in the host genome. Despite a lot of positive results have been obtained with viral vectors, their limited use is mainly related to concern on their safety. For this reason non viral vectors have attracted a lot of interest because they display many advantages with respect to viral vectors, such as lower immunogenicity, lower costs of production and better stability. Basically, non viral vectors belong to two classes: cationic polymers and cationic lipids. Both of them have a positive charge so they can self-assemble to nucleic acids which are instead negative molecules. The assembling process leads to the formation of complexes called lipoplexes or polyplexes if the vector is either a lipid or a polymer. These complexes have to be internalized by the target cells and the genetic material has to be delivered to the right destination that is the nucleus, if DNA is used, or the cytoplasm, if RNA is used. Once the transfected nucleic acids reach the final destination, the main objective of gene delivery can be considered fulfilled. Among non viral vectors, cationic lipids are the most commonly used. A large number of them has been synthesized and good results have been obtained. Although the presence of structural differences, cationic lipids vectors are all characterized by a common chemical structure: a cationic head group, an hydrophobic domain and a linker group. Many studies have been conducted in the last decades to define which are the proper chemical conformations of these three domains. The comparison between these studies leads sometimes to conflicting results and this is mainly due to the fact that the head, the linker and the hydrophobic groups influence the behavior of a lipid at once. In this scenario, comparative screening of large libraries in which each transfectant differs from one another for minor details gave sometimes the possibility to improve vectors structure obtaining higher transfection efficiencies and lower cytotoxicity at once. For this reason a comparative screening of a large library of lipid vectors was assessed and, up to now, 16 different lipids have been synthesized and characterized in the same conditions. One of the main requirements of gene delivery vectors is the ability to effectively complex and condense nucleic acids. DNA complexation ability of all the synthesized lipids have been thus evaluated by fluorophore-exclusion titration assay. Once the complexation occurs, the following step in the transfection process is the internalization of lipoplexes into target cells. To promote internalization, lipoplexes have to be positively charged in order to interact with the negative plasma membrane, and their dimension should be in the sub-micrometric range. Surface charge (ζ-potential) and size (hydrodynamic diameter) of lipoplexes were evaluated by dynamic light scattering (DLS) and by Laser Doppler Velocimetry, respectively. Finally transfection efficiency of each lipid was assessed with a luciferase reporter system while its linked cytotoxicity was evaluated with AlamarBlue cell viability assay. Despite the number of cationic lipids analyzed, it was not possible to identify a lipid vector bringing together all the ideal features. Of note, the comparisons between all the analyzed vectors disclosed important evidences related to the chemical structure of the hydrophobic chain and to the role of guanidinium group in the transfection process. All the obtained results pave the way to further investigation, by focusing on additional possible chemical modifications on lipid structure, with the final goal to obtain a cationic lipid vector including all the expected features that leads to high transfection efficiency and low citotoxicity.

Uno dei compiti principali di tutte le cellule è la sintesi proteica, processo che porta alla produzione di proteine, molecole che non solo determinano la struttura della cellula ma che permettono anche l’espletamento di tutte le principali funzioni cellulari. Tutte le cellule di un individuo contengono lo stesso identico genoma tuttavia sono in grado di differenziarsi esprimendo solo i geni codificanti per le proteine che ciascuna necessita. Purtroppo, l’insorgere di mutazioni genetiche può comportare la sintesi di proteine anomale, responsabili dello sviluppo di gravi condizioni patologiche. In questo contesto la terapia genica offre la possibilità di "correggere" i geni mutati controllando e modificando l'espressione proteica cellulare. Grazie alle sue innumerevoli applicazioni, questa terapia innovativa è stata sperimentata nella cura non solo di malattie genetiche ma anche di altre patologie, ad esempio cardiopatie, cancro etc.. La terapia è basata sulla tecnica del “gene delivery” ovvero sulla veicolazione di materiale genetico verso le cellule bersaglio, favorendo così o un incremento della sintesi di proteine “buone” o un decremento della sintesi di quelle “dannose”. La buona riuscita della veicolazione è fortemente influenzata dalla strategia di somministrazione utilizzata. La somministrazione diretta di materiale genetico “nudo”, a livello tissutale o nella circolazione sistemica, è probabilmente l'approccio più semplice e sicuro ma risulta essere quasi del tutto inefficace. Per superare alcuni degli ostacoli che compromettono, in modo significativo, la corretta veicolazione del materiale genetico sono state sviluppate una serie di tecniche fisiche che, nonostante abbiano permesso l’ottenimento di risultati promettenti, non risultano sempre efficaci in quanto gli inconvenienti generati superano spesso gli effetti positivi ottenuti. Per questo motivo, l’attenzione si è focalizzata sulla ricerca di un vettore in grado di promuovere l'internalizzazione del materiale genetico, all'interno delle cellule bersaglio, e, allo stesso tempo, di proteggere quest'ultimo fino al raggiungimento della destinazione finale. Tutti i vettori esistenti appartengono sostanzialmente a due categorie: vettori virali e vettori non virali. La capacità dei virus di infettare una grande varietà di cellule eucariotiche è il motivo che sta alla base del loro utilizzo come vettori. Ovviamente, prima di essere utilizzati i virus devono essere ingegnerizzati: la loro virulenza deve essere controllata e il materiale genetico di interesse, deve essere inserito all’interno del loro genoma. Nonostante i molteplici risultati positivi ottenuti, il loro utilizzo è limitato principalmente dai problemi relativi alla sicurezza del paziente. Per questo motivo i vettori non virali hanno suscitato un sempre crescente interesse e, sebbene i vettori virali sembrino essere maggiormente efficienti, quelli non virali mostrano alcuni notevoli vantaggi, ad esempio, sono meno immunogenici, comportano minori costi di produzione e possiedono una migliore stabilità. Principalmente i vettori non virali appartengono a due categorie: i polimeri cationici e lipidi cationici. Entrambi sono carichi positivamente e ciò consente loro di auto-assemblarsi con gli acidi nucleici che, contrariamente, sono molecole negative. Il processo di assemblaggio porta alla formazione di complessi chiamati lipoplessi, se il vettore utilizzato è un lipide cationico, o poliplessi, se il vettore è un polimero cationico. Questi complessi devono quindi essere internalizzati dalle cellule bersaglio e successivamente, il materiale genetico deve essere rilasciato nella corretta destinazione: il nucleo, se il materiale genetico trasfettato è il DNA, o il citoplasma, se contrariamente viene usato RNA. I lipidi cationici sono i vettori non virali più comunemente utilizzati. Al di là delle differenze strutturali tra i vettori lipidici esistenti, essi sono tutti caratterizzati dalla stessa struttura chimica di base: una testa cationica, un dominio idrofobico e un gruppo linker. Negli ultimi decenni sono stati condotti diversi studi aventi come scopo la ricerca delle più appropriate conformazioni chimiche di questi tre domini. Il confronto tra i risultati ottenuti da questi studi porta talvolta a conclusioni contrastanti e questo è dovuto principalmente al fatto che la testa, il linker e gruppo idrofobico influenzano contemporaneamente il comportamento di un lipide. Analisi comparative di grandi classi di vettori in cui ciascuno differisce dagli altri per minimi dettagli ha spesso offerto la possibilità di identificare un vettore che garantisse contemporanteamente una buona efficienza di trasfezione e una bassa tossicità. In questo scenario si inquadra lo scopo di questo lavoro di tesi che è sostanzialmente uno screening comparativo di una libreria di vettori lipidici. Finora 16 lipidi diversi sono stati sintetizzati e caratterizzati nelle stesse identiche condizioni. Uno dei principali requisiti che un vettore deve possedere riguarda la capacità di complessare e condensare efficacemente gli acidi nucleici. L’efficienza di complessazione di tutti i lipidi sintetizzati è stata quindi valutata attraverso un saggio fluorimetrico. Nel processo di trasfezione, una volta avvenuta la complessazione degli acidi nucleici, il passo successivo consiste nell’ internalizzazione dei lipoplessi da parte delle cellule bersaglio. Per promuovere l'internalizzazione i lipoplessi devono possedere una carica positiva, per interagire con la membrana plasmatica carica negativamente, e una dimensione submicrometrica. La carica superficiale (potenziale ζ) e le dimensioni (diametro idrodinamico) dei lipoplessi sono state valutate rispettivamente mediante la tecnica DLS (Dynamic Light Scattering) e la tecnica Laser Doppler Velocimetry. Infine l’efficienza di trasfezione di ogni lipide è stata valutata trasfettando le cellule mediante l’utilizzo di un plasmide ingegnerizzato con il gene codificante per la luciferasi mentre la loro citotossicità è stata valutata attraverso il saggio di vitalità cellulare AlamarBlue. Nonostante il numero di lipidi cationici analizzati, non è stato possibile individuare un vettore lipidico che possedesse tutte le caratteristiche ideali; dai risultati ottenuti è stato però possibile trarre importanti informazioni riguardo l’ottimizzazione della struttura chimica della catena idrofobica e il ruolo del gruppo guanidino nel processo di trasfezione. Pertanto, i risultati ottenuti aprono la strada ad ulteriori indagini mediante l'analisi di una nuova libreria di composti, recanti nuove caratteristiche strutturali, con l'biettivo finale di individuare un lipide cationico con un’elevata efficienza di trasfezione e una bassa citotossicità.