Molecular interactions of DNA with transfectants : a study based on infrared spectroscopy and quantum chemistry in aid to fluorescence spectroscopy and DLS analyses

The aim of this thesis is to assess the use of vibrational spectroscopy for the characterization of the molecular species involved in transfection. Care has been paid to attempt to work in conditions (i.e. concentrations) close to those employed to transfect cells. The DNA marker band has been used to monitor the complexation between the non-viral-polymeric vector and DNA and the conformational changes in the DNA structure. The experimental work is divided in two parts. The first part characterizes transfection with a series of established techniques; the second part focuses on the IR spectroscopy of the polyplexes (DNA-polymer complexes). We have analysed the solutions of transfection complexes to the lowest possible concentration (ssDNA = 0.3 mg/ml) for which we can detect reliable IR signals, which is about 15 times the value employed for biological application (ssDNA = 0.02 mg/ml). These samples were prepared with a standard protocol based on the N/P ratio. The characterization of deoxyribonucleic acid was made on salmon sperm DNA (ssDNA), that has low molecular weight, so precipitation didn’t occur. Two polymers at different molecular weights have been considered, namely linear PEI (l-PEI, 2.5 kDa, 25 kDa and 250 kDa) and Poly-L-lysine (PLL, 1-5 kDa, 15-30 kDa and 75-150 kDa). The solutions of DNA/polymers complexes were prepared by controlling several parameters, among which the most relevant is the charge ratio amines/phosphates, denoted as N/P. IR spectroscopy allowed monitoring the changes in position of the marker DNA band (antisymmetric phosphate stretching), upon interaction with the polymers and conformational changes from B-form to A-form. The observed behaviour was confirmed by literature study, showing the link between the position of the marker band of DNA and the different conformations of DNA [1, 2, 3]. These spectroscopic variations provide a useful probe of DNA structure modification upon complexation with cations or polymers. This behaviour was confirmed with the spectra of polymer-DNA complexes at high DNA concentration (1.5 mg/ml). Due to experimental noise in the weaker IR signal, it has been more difficult to observe this phenomenon at lower DNA concentrations, even if trends with N/P can be recognized. Follow-up investigations could consider quantum-chemical models for the detailed evaluation of conformational effects on the position of DNA marker. On the experimental side, another investigation could consider the effect of environmental pH on the polyplexes. This could be useful to understand the behaviour and stability of polyplexes in the different compartments of the cell.

Lo scopo di questa tesi è di utilizzare la spettroscopia vibrazionale per la caratterizzazione dei complessi trasfettante/DNA. È stata data molta attenzione alle condizioni di lavoro (es. concentrazioni) avvicinandosi il più possibile a quelle impiegate per trasfettare le cellule. Lo scopo è di studiare il comportamento di bande caratteristiche che possono essere utilizzate per monitorare la complessazione tra i vettori non virali polimerici e DNA, e la variazione della struttura conformazionale del DNA durante questa interazione. La caratterizzazione del complesso nel suo insieme, come visto in letteratura, viene effettuata con tecniche e saggi noti. Lo scopo questa tesi, oltre alla caratterizzazione classica dei complessi, è l’analisi dal punto di vista molecolare del comportamento delle specie coinvolte nella trasfezione e della loro possibile modifica conformazionale durante l’interazione. Per fare ciò è stata utilizzata la spettroscopia vibrazionale IR, cercando di avvicinarsi il più possibile alle condizioni con cui queste sostanze vengono somministrate alle cellule. Questo lavoro sperimentale è dunque strutturato in due parti, la prima riguardante l’applicazione delle analisi tradizionali per valutare l’efficienza di trasfezione e di complessazione. Invece la seconda parte della tesi considera l’utilizzo della spettroscopia IR per l’attribuzione delle bande caratteristiche del DNA e dei polimeri operando a bassi valori di concentrazioni. La caratterizzazione dell’acido desossiribonucleico è stata fatta su salmon sperm DNA (ssDNA) dimostrando che il segnale minimo utile era ottenuto alla concentrazione 0.3 mg/ml, che è 15 volte maggiore al valore utilizzato in trasfezione (0.02 mg/ml). La caratterizzazione dei polimeri, è stata fatta anch’essa a diverse concentrazioni per capire se il segnale di questo interferiva con le frequenze marker usate per caratterizzare il DNA. Sono stati considerati due polimeri a tre diversi pesi molecolari ciascuno, ovvero la Polietilenimina lineare (l-PEI) e la Poli-lisina lineare (PLL), entrambi solubilizzati in dH2O e preparati alle concentrazioni desiderate. Le soluzioni di complessi DNA/polimero sono state preparate controllando diversi parametri, tra i quali il più rilevante è il rapporto di carica amine/fosfati, N/P. E’ stato possibile osservare le variazioni di posizione di un picco di riferimento del DNA (stiramento antisimmetrico dei gruppi PO2-) a seguito dell’interazione DNA-polimero e delle variazioni conformazionali del DNA dalla forma B alla forma A. Il comportamento osservato è stato confermato su base bibliografica, che mostra un legame tra la frequenza caratteristica dei picchi di assorbimento e le diverse conformazioni del DNA [1, 2, 3]. Queste variazioni spettroscopiche hanno fornito la prova sperimentale utile della modifica conformazionale del DNA una volta complessato con polimeri cationici. Dato che le misure sono state effettuate a basse concentrazioni di DNA, in alcune misure si sono riscontrate fluttuazioni statistiche del segnale IR. È stato comunque possibile osservare un chiaro trend al variare le condizioni sperimentali. Un possibile sviluppo futuro è quello di verificare dal punto di vista chimico computazionale il comportamento del complesso DNA/polimero e formulare una spiegazione strutturale dettagliata che spieghi tale comportamento. Ulteriori analisi possono essere fatte apportando modificando le condizioni al contorno dei complessi, ad esempio variando il pH per capire come si comporta il poliplesso nei diversi compartimenti cellulari.