Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche per il delivery di Sirna in applicazioni biomediche

Il lavoro di tesi svolto parte dall’idea di utilizzo di un farmaco potenzialmente molto efficace in campo farmaceutico: il siRNA, letteralmente ‘small interference RiboNucleic Acid’. Il siRNA rappresenta un drug capace di bloccare la traduzione di mRNA (RNA messaggeri) portanti i codici genetici, in particolar modo delle proteine responsabili della proliferazione delle cellule tumorali, ma anche nella lotta a molte malattie genetiche (AIDS, diabete, SLA…) Il suo alto peso molecolare ( 13KDa)unito alla sua natura anionica fanno si che il siRNA non sia in grado di attraversare autonomamente le membrane cellulari così da essere internalizzato all’interno delle cellule. Inoltre, la sua ridotta stabilità in ambiente fisiologico e la sua facile degradazione in ambiente cellulare rendono il suo utilizzo strettamente dipendente dall’impiego di un nanocarrier ,biocompatibile e biodegradabile, che riesca a trasferirlo e rilasciarlo integro direttamente all’interno della cellula, in modo da permettere l’esplicazione delle proprie funzioni. Per questo motivo si è impostata la ricerca sulla sintesi di nanoparticelle polimeriche, positivamente cariche, in grado di assorbire superficialmente il siRNA, molecola di natura anionica,, mediante interazioni elettrostaiche. L’idea è quella di utilizzare tali nanoparticelle come nanocarrier per il delivery del siRNA in applicazioni biomediche. Per fare ciò le nanoparticelle dovranno essere in grado di proteggere efficacemente il siRNA dal degrado in ambiente biologico e di permetterne l’internalizzazione all’interno della cellula. In particolare il lavoro di tesi si è incentrato sulla sintesi e la caratterizzazione di macromonomeri biodegradabili funzionalizzati, carichi positivamente e polimerizzabili mediante polimerizzazione radicalica in emulsione (FREP) per l’ottenimento di nanoparticelle dotate di carica superficiale positiva. I nuovi materiali partivano dall’idea di creare un comb-like polymer costituente i nanovettori, le cui cariche positive fossero dislocate il più possibile sulla superficie delle particelle. L’ elaborato di tesi, per i motivi citati, parte dalle conoscenze della ricerca precedentemente svolta dal gruppo accademico del Professor D. Moscatelli in cui le nanoparticelle venivano sintetizzate utilizzando come monomeri il poly-methyl-methacrylate (PMMA) o il poly-ε-caprolactone (PCL), il secondo sia biocompatibile sia biodegradabile ed il primo solo biocompatibile, e soprattutto come surfmer il 2-(methacryloyloxy)-ethyl-ammonium chloride(Hema-Ch+). Il polimero costituente le nanoparticelle risultava avere una struttura a “pettine”, formato da un backbone di poli-HEMA e da catene laterali lipofile di PCL e di Hema-Ch+. Il motivo fondamentale per cui si è deciso di andare oltre questa formulazione riguarda l’attività biologica del siRNA, il quale una volta assorbito sulla superficie ed internalizzato tramite il delivery delle nanoparticelle, viene rilasciato durante il degrado di quest’ultime in ambiente cellulare. Con questa formulazione infatti il siRNA si trovava legato, mediante interazione elettrostatica, alla carica positiva dell’Hema-ch+ e di conseguenza al backbone costituente la catena polimerica, che è l’ultima parte della nanoparticella a degradare. Questo faceva si che il siRNA, una volta internalizzato, rimaneva comunque legato ai frammenti del backbone della nanoparticella che stava degradando, e questo ne comprometteva sensibilmente l’attività biologica. Le prove effettuate erano risultate molto buone sotto l’aspetto della tossicità e dell’internalizzazione cellulare, ma mostravano dei limiti nel campo, appunto, del silenziamento del gene target (scarsa attività biologica del siRNA). La ricerca sperimentale svolta si è posta come obiettivo la sintesi di macromonomeri di poli-ε-caprolattone (PCL) e poli-lattide (PLA), funzionalizzati con colina al termine della catena lipofila, in modo tale che la carica positiva non fosse più collegata direttamente al backbone di poli-HEMA ed il siRNA assorbito superficialmente venisse rilasciato in modo più efficiente e senza perdita di attività biologica, aspetto assolutamente imprescindibile. In seguito si è fatto anche un piccolo passo nel campo della polimerizzazione RAFT, cercando di sintetizzare copolimeri a blocchi costituiti da PCL (cuore idrofobo), HEMA-PEG (Mw=1000 o 2000 Da) (shell idrofilo), quest’ultimo collegato con il macromonomero funzionalizzato mediante la colina, in grado di self-assemblare in ambiente acquoso grazie alla loro natura anfifilica, generando micelle o nanoparticelle cariche positivamente (tramite il processo fisico di nanoprecipitazione).