Advanced microfluidic platforms for investigating the role of microenvironmental signaling on stem cell fate

In vivo, cells are surrounded by a complex multi-factorial environment characterized by specific physicochemical properties (temperature, pH, oxygen tension), which provide cells with exogenous stimuli deriving from soluble factors, cell-matrix interactions, and cell-cell contacts. The orchestrated and spatio-temporally dynamic interplay of these biochemical and physical extracellular cues, referred to as cell microenvironment, regulates cells structure, function and behavior, ultimately guiding their fate 1,2. Considering the complexity of the native cell microenvironment, in vitro models are required as tools for better understanding the key pathways regulating cells behavior. In order to achieve reliable and biologically relevant results, such models should feature the ability to in vitro recapitulate the dynamic combinatorial role of soluble factors, matrix-bound cues, cell-cell contacts and cell-matrix adhesions on cell responses. To date, much of the current understanding in cell biology relies on traditional bi-dimensional (2D) in vitro cell culture models, which mainly consist in the static culture of cells seeded on polystyrene flat surface plates (mm to cm in characteristic dimension). Such substrates, however, poorly mimic the native cellular microenvironment, featuring levels of stiffness that are orders of magnitude higher than those found in vivo and lacking in presenting 3D cues typical of the native cell physical environment. In the past few decades, several attempts have been made to address these issues proposing macroscale 3D culture models relying on innovative biomaterials, often combined with laboratory-scale bioreactors 3. Although providing a more reproducible and controlled approach to investigate mechanisms of cell behavior within a 3D environment and to engineer functional constructs, these approaches still have to deal with size-scales that are orders of magnitude bigger than the native microenvironment. Recently, microscale and microfluidic technologies are finding increasing applications as innovative approaches in cell biology studies, enabling an unprecedented control over the cellular microenvironment while reducing the time and the scale of experimental platforms for better matching the cellular level 4. Moreover, they allow for automating and parallelizing experimentations and coupling cell cultures directly with high-throughput analysis systems, thus improving simultaneously model accuracy and experimental throughput 5. Considering these premises, microfluidic platforms represent promising in vitro models, increasingly exploited as enabling tools in the field of cell biology, from the screening of drugs or molecules, to the optimization of culture conditions for inducing specific cell fates. In this scenario, the aim of this research is the development of microfluidic platforms and techniques as tools for investigating and modeling the effect of different cues from the cellular microenvironment in addressing stem cell fate. In details, four microscale platforms and/or techniques, ad hoc conceived in the context of national and international collaborations, are presented in the following chapters. Each chapter is focused on a single platform and underlines how a specific microfluidic strategy has been applied to the definition of an innovative technological solution for addressing a specific biological goal.

In vivo, le cellule sono circondate da un ambiente complesso multifattoriale caratterizzato da specifiche proprietà meccaniche e fisiche (temperatura, pH, ossigeno), le quali generano sulle cellule stimoli esogeni tramite fattori solubili, interazioni cellula-matrice e contatti cellula-cellula. L’interazione di questi fattori extracellulari, che variano dinamicamente nello spazio e nel tempo, regola struttura, funzioni e comportamento cellulare, e viene definita nel complesso microambiente cellulare. Considerando la complessità del microambiente cellulare nativo, sono necessari modelli in vitro da utilizzare come strumenti per una miglior comprensione delle pathways fondamentali che regolano il destino cellulare. Con lo scopo di ottenere risultati ripetibili e biologicamente rilevanti, questi modelli dovrebbero possedere la capacità di replicare in vitro l’effetto dinamico e combinatorio di fattori solubili e interazioni cellula-matrice e cellula-cellula sulle risposte cellulari. Ad oggi, la maggior parte delle conoscenze nel campo della biologia cellulare derivano da modelli di coltura cellulare tradizionali e 2D, che consistono per lo più in colture statiche di cellule seminate su superfici piane di polistirene (mm to cm di dimensioni caratteristiche). Questi substrati, tuttavia, riproducono con poca fedeltà il microambiente cellulare nativo, mostrando livelli di rigidità ordini di grandezza superiori di quelli trovati in vivo e fallendo nel mostrare i segnali 3D tipici del ambiente fisico nativo. Nelle ultime decadi, molti tentativi sono stati fatti per risolvere questi limiti attraverso modelli di coltura cellulare 3D alla macroscala sviluppati sulla base di biomateriali innovativi, spesso combinati a bioreattori da laboratorio. Sebbene forniscano un approccio più riproducibile e controllato per investigare i meccanismi di comportamento cellulare in ambienti 3D e per ingegnerizzare costrutti funzionali, questi approcci mostrano ancora dei limiti relativi alla loro scala dimensionale che è ordini di grandezza più elevata del microambiente nativo. Recentemente, tecnologie alla microscala e microfluidiche stanno trovando crescente applicazione come approcci innovativi per studi di biologia cellulare, permettendo un controllo senza precedenti sul microambiente cellulare e riducendo la dimensioni e le tempistiche delle piattaforme sperimentali per ottenere una miglior corrispondenza con la scala cellulare. Inoltre, questi approcci alla microscala permettono lo sviluppo di esperimenti automatizzati e parallelizzati e l’accoppiamento diretto delle colture cellulari con sistemi di analisi high-throughput, così da migliorare simultaneamente l’accuratezza del modello e il throughput sperimentale. Considerando queste premesse, le piattaforme microfluidiche rappresentano promettenti modelli in vitro, utilizzati sempre di più come strumenti nel campo della biologia cellulare, dallo screening di farmaci o molecole, all’ottimizzazione di condizioni di coltura per indurre specifici destini cellulari. In questo contesto, lo scopo di questa ricerca è lo sviluppo di piattaforme e tecniche microfluidiche come strumenti per investigare e modellizzare l’effetto di diversi stimoli del microambiente nell’indirizzare il destino cellulare. Nel dettaglio, nel seguente progetto di tesi sono presentate quattro piattaforme/tecniche alla microscala, progettate ad hoc nel contesto di collaborazione nazionali e internazionali. Ogni capitolo è focalizzato su una singola piattaforma e sottolinea come una specifica strategia microfluidica sia stata applicata per la definizione di una soluzione tecnologica innovativa per ottenere un determinato risultato biologico.