Influence of growth factors and drug delivery systems on cartilage maturation

Abstract I. Introduction Osteoarthritis (OA) is the most common articular disease and it is one of the principal causes of invalidity in people aged over 60 years. Due to the avascular, aneural and hypocellular structure, damaged cartilage cannot repair or regenerate itself. Nowadays, there are some surgical strategies for cartilage repair, but each one brings positive aspects as well as limitations. The interest to relieve the OA pains, developing a new strategy, acts as motor for a wide project carried by the School of Pharmacy and Pharmaceutical Science of Cardiff University. The research work for this thesis is part of that larger project: it took place at School of Pharmacy of Cardiff University, in collaboration with the School of Engineering of Cardiff University and the department of Biological Sciences of Swansea University. This thesis work has focuses on the examination of cartilage subjected to six different treatments in-vitro. The interest was about growth factors and drug delivery system effect on cartilage. The aim was to induce the maturation of articular cartilage using combination of growth factors and polycationic polymers, to enhance the growth factor action. A second objective was to measure the effectiveness of the mixture involved, using two parallel approaches: a mechanical analysis and a biochemical one. For the mechanical characterization purpose a commercial rheometer and a house-made friction rig and suitably developed protocols have been utilized. Afterwards, the mechanical properties were related to changes in cartilage structure, such as glycosaminoglycans and collagen content, obtained during the biochemical analysis. The latest are the component of the extracellular matrix and provide the cartilage mechanical properties. II. Materials and Methods The analysis was finalised to identify the best mix within a selection of possible growth factors and polymers combinations. Cartilaginous samples utilised have been extracted by biopsy from 6 months old bovine feet. Figure 1: workflow of sample extraction. Cleaning (a), skin removal (b), joint opening (c), metatarsus isolation (d), punching (e), surface punched (f), extraction with blade (g) and extraction completed (h). Once extract, cartilage needs to be treated to maintain its vitality. The culture took place in a 24-well plate in a humidified incubator: each well admitted a cartilage sample filled by a medium. The samples were splitted in slots and treated in different ways, over the serum-free culture medium: o without growth factors; o with growth factors TGF-β1 and FGF-2; o with growth factors TGF-β1 and FGF-2 coupled with a polymer named A2-1; o with growth factors TGF-β1 and FGF-2 conjugated with a polymer named A2-1; o with growth factors TGF-β1 and FGF-2 coupled with a polymer named A5-2; o with growth factors TGF-β1 and FGF-2 conjugated with a polymer named A5-2, and analysed at different time points: 3 days, 1 week, 2weeks and 3weeks of treatment. II.a Mechanical analysis In order to evaluate the mechanical role of treated cartilage in the joint system, rheological and frictional tests were performed: the first one was done with the purpose to appraise the damping capability of cartilage and the second one for the lubrication. To have consistency of data, all tests were performed on three animals and then an average value was computed. Since cartilage is a composite material constituted by a solid portion (ECM) and a fluid one (synovial fluid), it can be represented by the laws of viscoelasticity. To be able to determine the viscoelastic properties, an entire rheological protocol has been developed, imitating daily life solicitations on articular joints. The rheometer (Figure 2) with parallel disks is capable to apply simultaneously a frequency sweep and a normal force on cartilage samples. Figure 2: rheometer AR-G2 from TA-Instruments. A frequency sweep torque was performed from 10Hz to 0.01Hz, the temperature was fixed at 37°C, and different loads were applied on samples in sequence, to test natural and extreme situations. Setting the normal force F, the pressure P applied by the rheometer on the cartilage can be easily derived (P=F/surface): F (N) 1 10 25 50 P(MPa) 0.051 0.510 1.275 2.551 During the 70 min of the experiment the specimen could not dry because its lateral surface was covered by silicon oil. To maintain the cartilage in the correct lodging for all over the running of the test, a fine sandpaper was glued to the rheometer plates. The rheometer was connected to a computer terminal and through an appropriate software, TRIOS®, it was possible to record the values of complex modulus, storage modulus, loss modulus and phase angle of the solicited cartilage. In natural joints, cartilage is always in contact and in relative motion with other cartilage. To evaluate the friction developed between two surfaces in relative motion, it is usually considered the coefficient of friction. A pin-on-plate tribometer was used (Figure 3) in order to measure frictional force developed between cartilage and a glass surface, allowing an easy extraction of the parameters from the model. Figure 3: illustration of the friction rig. The testing set up enables to load the samples during the investigation, thus, 2N and 25N were chosen, applying different masses on the head arm. The friction force was the output of the rig and then was calculated the associated frictional coefficient, based on the calibration curve. During the test, the cartilage was under the head of a movable arm and lied on the glass plate. The latter rotated with help of a voltage controlled engine and so the movable arm passively moved and touched the sensor, that was firmly attached to an immovable arm. Cartilage was maintained fixed to the immovable arm using super glue. Phosphate-buffered-saline was used with the double aim of lubricant and to prevent dehydration of the sample during the test. The plate speed was precisely controlled using a stabilized power supply. Each voltage setting was correlated to a specific rotational speed. The force sensor was connected to a data acquisition device and voltage was recorded on a computer terminal, running the software LABView (National instruments). II.b Biochemical analysis A biochemical analysis, in terms of quantification of glycosaminoglycans and collagen, was performed with the purpose to establish a correlation between the mechanical properties and the ECM structure. The content of ECM components was assayed both on cartilage digest and on culture media. The cartilage digestion was obtained adding Papain & Digestion Buffer to eppendorf containing the samples. Subsequently, part of the digest was used for the glycosaminoglycan assay and another part for the collagen assay. Following a protocol found in literature, the GAG content was tested in a 96-well plate, adding dimethylmethylene blue to the digest or culture media and reading with a spectrophotometer at 540nm (Figure 4). Figure 4: 96-well plate ready to be read by the spectrophotometer. The first three rows were used for the calibration curve. As regards the collagen assay, a protocol had been developed, starting from informations found in literature. The cartilage digest or culture media was first treated with hydrochloric acid, then with chloramines T, propanol, perchloric acid and dimethylaminobenzaldehyde. After the reacting time, the 96-well plate was read at 570 nm on a spectrophotometer. III. Results The analyses were performed for each different cartilage treatment at each time point. The results reported are the average of the three replicates obtained from different animals. With regard to rheological experiments, it was paid more attention on complex modulus (G*) and phase angle (φ). Figure 5 shows an example of common behavior. Figure 5: example of complex modulus and phase angle curves. General considerations were found valid for every set of experiment. The trend of the complex modulus follows these characteristics: • it is higher at high frequencies and decreases gradually achieving low frequencies; • it is dependent on the normal force applied; • the curves obtained at different loads are distinct and sorted in increasing order with respect to the increasing load. For the phase angle, more variability was encountered, however a common trend was anyway found: • it is higher at low frequencies and decreases for high frequencies; • the curves shape is corrugated; • the phase angle is dependent on the normal load applied; • the curves at different loads are distinct, even if sometimes crossed, and sorted in decreasing order with respect to the increasing load. Instead, looking at the specific trends, two points of view were taken in consideration: 1. temporal evolution for each category; 2. comparison between different category, at fixed time point and load. As concerned friction testing, the data utilised for the elaboration were taken after the oscillation due to the collision between the two arms. The coefficients of friction were calculated with the support of Excel and then they were plotted with box and whiskers diagrams. Figure 6 shows a representative behaviour. Figure 6: example of coefficient of friction representation. As a general trend, it was found that all the specimens had a behaviour comparable with the control, that was obtained from fresh biopsied cartilage. Looking at the specific trends, the same two points of view were taken in consideration: 1. temporal evolution for each category, in condition more similar to reality, so at high load and low speed; 2. comparison between different category, at fixed time point and load, always at low speed. The biochemical analyses reveal that the articular cartilage maturation has been induced successfully both with the simple mixture of growth factors and the growth factors with delivery system (polymers). In fact, the tables below (Table 1, Table 2) indicate the rate of increasing or decreasing content of glycosaminoglycans and collagen in cartilage digest with respect to the control and there is an over all improvement in ECM content. The highest values are found for the treatment with and without growth factors and for the growth factors conjugated to the polymer A2-1. Table 1: rates of increasing or decreasing content of glycosaminoglycan of treated cartilage digest, at four different time points. Days Increasing/decreasing rate of GAG in % respect to the control WOGF WGF A2-1mix A2-1conj A5-2mix A5-2conj 3 123 150 -20 27 -16 -37 7 177 137 -25 55 56 -8 14 190 203 18 46 -30 -18 21 60 102 94 46 40 8 Table 2: rates of increasing or decreasing content of hydroxyproline in the cartilage digest treated in all the ways explained, in time evolution. Days Increasing/decreasing rate of Hydroxyproline in % respect to the control WOGF WGF A2-1mix A2-1conj A5-2mix A5-2conj 3 42 30 10 26 16 30 7 56 76 -10 20 54 60 14 81 80 32 37 23 26 21 44 19 44 62 31 36 The level of glycosaminoglycans content released in the media during the culture was found, as expected, complementary to the values obtained from the cartilage digest. Instead, the amount of hydroxyproline released in the culture medium resulted in insufficient quantity to be read by the method used for the cartilage digest: it means that the collagen product is all maintained within the cartilage. IV. Discussion and conclusions The analysis of the complex modulus data allows one to assess the stiffness of cartilage under different loading conditions. In particular, normal loading rates and impact loading of daily activity can be represented by low and high frequencies dynamic tests. At high frequencies the complex modulus and the real part of the modulus are higher with respect to those measured at lower frequency. Indeed, this evidence is due to the fact that most of the hydrostatic stress component is carried by the fluid. Cartilage has an excellent lubricating property, allowing a low friction, and so it is desirable not to lose its lubricant capability when growth factors are used to gain tissue mechanical properties. A good result is considered when the coefficient of friction of the treated cartilage is not significantly higher than the control one. “Simple growth factor” treatment The stiffness of cartilage treated with growth factors was higher than the stiffness of normal cartilage, even if growth factors need time before giving the expected result. It would be expected that samples exhibiting higher stiffness will also exhibit higher friction. However, all friction data found for this group of samples were close to the values found for the control samples, or even lower. “Growth factors and polymer mix” treatment The stiffness and the coefficient of friction measured in this set of samples are higher than the ones in the set of simple growth factor stimulation, already at three days. The polymer give an intrinsic stiffness and being a macromolecule helps the lubrication. The GAG content is not as high as it would be expected on the basis of the rheology. Chondrocytes may have been stressed because that loss is compensated by the considerable value of GAG released in the culture media. On the other, the collagen content is higher than control and this justifies the mechanical properties. The collagen content is almost stable during the whole observation time window and not too much different from the simple growth factor treatment. “Growth factors conjugated with polymer” treatment The results found for this group of samples are qualitatively similar to that found for samples with growth factors and polymer mix. However, from the quantitative point of view the GF conjugated with polymer resulted in higher values of stiffness: conjugated polymer improves the growth factor action. As regard friction, the difference in the chemical link between growth factors and polymer, respect to the previous set, gives better results. The coefficient of friction is lower than the mixed treatment, but anyway higher than the simple growth factor one. In the end, all the data of this set are ranged in the one of the control. Conclusions The aim of the present project was to induce the maturation of articular cartilage using combination of growth factors and polymers, to enhance the simple growth factor action. To evaluate the success of the idealised treatment two approaches have been used: a mechanical analysis and a biochemical one; then correlation between the results was sought. The survey was carried out following protocols suitably developed or adapted from existing ones found in literature. Rheological mechanical tests were used with the purpose to observe the viscoelastic properties of cartilage; furthermore, frictional tests were also carried out, which assays the superficial behaviour of cartilage. These two kinds of test were selected with the aim to see how the combination of growth factors with polymers can improve the cartilage maturation and consequent stiffness improvement, without losing the low friction property of native cartilage. It is known that through all the cartilage components, the proteoglycan-collagen matrix (ECM) is the one responsible of the mechanical properties. Indeed, biochemical analysis has focused on the quantification of glycosaminoglycans (which make up the proteoglycans) and collagen. Despite the scattering of results of biochemical assays, the comparison between the mechanical and biochemical tests have clearly shown that growth factors have a beneficial effect on the maturation process of cartilage and that polymeric carriers may improve the process.

Sommario I. Introduzione L’osteoartrite (OA) è la malattia articolare più frequente ed è una delle cause principali di invalidità nelle persone con età superiore ai 60 anni. La cartilagine non si autorigenera, specie se danneggiata, data la sua struttura carente di terminazioni nervose e cellule. Al giorno d’oggi, esistono alcune strategie chirurgiche per la riparazione della cartilagine, ognuna però ha vantaggi e limitazioni. L’intento di alleviare il dolore dell’OA ha portato la School of Pharmacy and Pharmaceutical Science dell’Università di Cardiff a sviluppare una nuova strategia per la rigenerazione della cartilagine. Il lavoro di ricerca della presente tesi è parte di questo ampio progetto: è stato quindi svolto presso la School of Pharmacy and Pharmaceutical Science dell’Università di Cardiff, la School of Engineering della medesima università ed il dipartimento di Biological Sciences dell’Università di Swansea. Nel presente lavoro di tesi si è focalizzato sull’esame di cartilagine sottoposta a sei differenti trattamenti in-vitro. L’interesse era focalizzato sugli effetti dei fattori di crescita e dei sistemi di veicolazione dei farmaci sulla cartilagine. L’obiettivo è stato quello di indurre la maturazione della cartilagine articolare usando combinazioni di fattori di crescita e polimeri policationici, per esaltare l’azione dei primi. Un secondo obiettivo è stato, di misurare l’efficacia delle miscele in questione, usando due approcci paralleli: un’analisi meccanica e una biochimica. Per la caratterizzazione meccanica sono stati utilizzati, sviluppando opportuni protocolli, un reometro commerciale e un banco prova artigianale per misurare l’attrito. In seguito, le proprietà meccaniche della cartilagine sono state messe in relazione con i cambiamenti strutturali, attraverso le analisi biochimiche dei quantitativi di glicosaminoglicani e collagene. Essi sono i componenti principali della matrice extracellulare e sono i responsabili delle proprietà meccaniche della cartilagine. II. Materiali e Metodi L’analisi era finalizzata all’identificazione della migliore miscela tra una selezione di possibili combinazioni di fattori di crescita e polimeri policationici. I campioni cartilaginei utilizzati sono stati estratti mediante biopsia (Figura 1) da zampe di bovini di circa 6 mesi. Figura 1: procedura di estrazione. Pulizia (a), rimozione della pelle (b), apertura dell’articolazione (c), isolamento del metatarso (d), punzonatura (e), superficie punzonata (f), estrazione con bisturi (g) ed estrazione completata (h). Una volta estratta, la cartilagine ha immediatamente bisogno di essere trattata per mantenere la sua vitalità. La coltura si è svolta in un piatto a 24 pozzetti posto in un incubatore umidificato. Ogni pozzo ospitava un campione di cartilagine immerso in un media. I campioni sono stati suddivisi e, oltre al terreno di cultura privo di siero, sono stati trattati secondo quanto segue: o senza fattori di crescita, o con fattori di crescita TGF-β1 e FGF-2; o con fattori di crescita TGF-β1 e FGF-2 miscelati con un polimero denominato A2-1; o con fattori di crescita TGF-β1 e FGF-2 coniugati con un polimero denominato A2-1; o con fattori di crescita TGF-β1 e FGF-2 miscelati con un polimero denominato A5-2; o con fattori di crescita TGF-β1 e FGF-2 coniugati con un polimero denominato A5-2. e analizzati in diversi momenti temporali: 3 giorni, 1, 2, e 3 settimane di trattamento. II.a Analisi meccaniche Sono stati effettuati test reologici e di attrito per valutare la meccanica della cartilagine trattata all’interno di un’articolazione: il primo per esaminare la capacità di smorzamento e il secondo per valutarne la lubrificazione. Per avere consistenza dei dati, tutti i test sono stati compiuti su tre animali, mediando poi i risultati. La cartilagine è un materiale composito costituito da una fase solida (ECM) e una fluida (liquido sinoviale) e in quanto tale può essere rappresentato dalle leggi della viscoelasticità. Per determinare le proprietà viscoelastiche, è stato sviluppato un protocollo reologico, imitando le sollecitazioni quotidiane agenti sulle articolazioni. Il reometro a dischi paralleli (Figura 2) è in grado applicare simultaneamente torsioni in frequenza e carico monoassiale. Figura 2: reometro AR-G2 di TA-Instruments. La frequenza della torsione applicata è stata da 10Hz a 0.01Hz; la temperatura di lavoro è stata fissata a 37°C e sono stati applicati in sequenza diversi carichi sullo stesso campione, per testare situazioni naturali ed estreme. Impostando la forza normale F, la pressione P applicata dal reometro sul campione è stata facilmente calcolata (P=F/Area): F (N) 1 10 25 50 P(MPa) 0.051 0.510 1.275 2.551 Per prevenire la disidratazione della cartilagine nel corso dell’esperimento, della durata di circa 70 minuti, sulla sua superficie laterale è stato applicato dell’olio siliconico; invece, per mantenerla correttamente alloggiata, è stata fissata una fine carta vetro ai piatti del reometro. Servendosi dell’apposito software TRIOS® è stato possibile collezionare i valori di modulo complesso (complex modulus), con le sue due componenti reale ed immaginaria (storage modulus e loss modulus), e l’angolo di sfasamento (phase angle). Il coefficiente di attrito è comunemente impiegato per valutare la forza di attrito che si sviluppa tra due superfici in moto relativo, quali anche due cartilagini in un’articolazione. Nel presente lavoro è stato utilizzato un tribometro pin-on-plate (Figura 3) per misurare la forza di attrito sviluppata tra la cartilagine e una superficie di vetro, permettendo una facile estrazione dei parametri del modello. Figura 3: illustrazione del banco prova per misurare la forza di attrito. Il set up di misurazione permetteva di applicare un carico al campione durante la prova, quindi sono stati impressi 2N e 25N alla cartilagine mediante l’uso di masse. L’output del sistema è stato la forza di attrito, dalla quale è stato poi calcolato il coefficiente di attrito tramite una curva di calibrazione. Durante la prova, la cartilagine era fissata mediante attaccatutto sotto la testa di un braccio mobile e giaceva sulla piastra di vetro. Quest’ultimo ruotava grazie ad un motore controllato in tensione e dunque il braccio mobile si muoveva passivamente toccando il sensore allocato sul braccio fisso. È stato utilizzato tampone fosfato salino (PBS) con un duplice scopo: come lubrificante e per prevenire la disidratazione della cartilagine durante l’esperimento. La velocità di rotazione del piatto è stata controllata con un alimentatore stabilizzato. Ad ogni valore di tensione impostato corrispondeva una velocità di rotazione. Il sensore di forza era connesso ad un dispositivo di acquisizione di dati; si registrava quindi la tensione su un computer tramite il software LABView (National Instruments). II.b Analisi biochimiche Per mettere in relazione le proprietà meccaniche con la struttura della matrice extracellulare è stata effettuata un’analisi biochimica, volta a quantificare i contenuti di glicosaminoglicani e collagene presenti sia nella cartilagine digerita da enzimi che nel media di coltura. La cartilagine digerita è stata ottenuta aggiungendo papaina e un tampone digestivo alle eppendorf contenenti i campioni. Successivamente, una parte del composto ottenuto è stata utilizzata per quantificare i glicosaminoglicani e una parte per il collagene. La procedura per la quantificazione del collagene è stata reperita in letteratura e prevedeva di leggere a 540nm con lo spettrofotometro un piatto a 96 pozzetti riempito di cartilagine digerita o media e blu di metilene (Figura 4). Figura 4: piatto a 96 pozzetti pronto per essere letto dallo spettrofotometro. Le prime tre righe sono state utilizzate per la curva di calibrazione. Per quanto riguarda la quantificazione del collagene, il protocollo è stato sviluppato partendo da informazioni presenti in letteratura. Il composto di cartilagine digerita o il media di coltura sono stati trattati prima con acido cloridrico, poi con cloramina T, propanolo, acido perclorico e dimetilaminobenzaldeide. Dopo aver aspettato l’opportuno tempo di reazione, il piatto a 96 pozzetti è stato letto a 570nm con uno spettrofotometro. III. Risultati Le analisi sono state svolte per tutti i tipi di trattamento e in tutti i momenti temporali prefissati. I risultati riportati sono la media delle tre repliche ottenute da tre diversi animali. Considerando i test reologici, è stata posta maggiore attenzione al modulo complesso (G*) e all’angolo di sfasamento (φ). In Figura 5 si osserva un andamento comune ai vari campioni. Figura 5: esempio di curve del modulo complesso e dell'angolo di sfasamento. Osservando tutti i set di dati sono emerse delle considerazioni generali. Il trend del modulo complesso ha le seguenti caratteristiche: • ha valori maggiori alle alte frequenze e decresce gradualmente alle basse frequenze; • è dipendente dalla forza monoassiale applicata; • le curve rappresentative dei diversi carichi sono distinte tra loro e ordinate in modo crescente rispetto all’incremento di carico. Studiando invece l’angolo di sfasamento, nonostante sia stata incontrata molta più variabilità, è comunque stato possibile trovare un trend comune: • i valori sono alti alle basse frequenze e decrescono con l’aumentare della frequenza; • la forma della curva è corrugata; • l’angolo di sfasamento è dipendente dal carico monoassiale applicato; • le curve rappresentative dei diversi carichi sono distinte, anche se talvolta si incrociano, e sono ordinate in modo decrescente rispetto all’incremento di carico. Per focalizzarsi invece sugli andamenti specifici, sono stati considerati due punti di vista: 1. evoluzione temporale per ogni categoria; 2. confronto tra le diverse categorie, fissando il riferimento temporale e il carico applicato. Nel test di attrito, i dati utilizzati per l’elaborazione sono stati presi dopo l’oscillazione dovuta alla collisione dei due bracci. I coefficienti di frizione sono stati calcolati in un foglio Excel per poi essere plottati con diagrammi box and whiskers (Figura 6). Figura 6: esempio di riferimento di coefficient di frizione. Come trend generale, è stato riscontrato che, avendo lo stesso ordine di grandezza, tutti i campioni hanno un comportamento comparabile a quello del controllo. Esaminando invece i trend specifici, sono stati considerati gli stessi punti di vista dell’analisi reologica: 1. evoluzione temporale per ogni categoria, in condizioni simili alla realtà, ovvero alto carico e bassa velocità; 2. confronto tra le differenti categorie, fissando il riferimento temporale e il carico applicato. L’analisi biochimica ha rivelato che la maturazione della cartilagine è stata indotta con successo, sia nei casi di utilizzo di soli fattori di crescita che con i sistemi di veicolazione. Infatti, le tabelle sottostanti (Tabella 1, Tabella 2) mostrano, rispetto al controllo, i tassi di crescita o decrescita dei contenuti di glicosaminoglicani e collagene, nel composto di cartilagine digerita e evidenziano una generale crescita del contenuto dell’ECM. I valori più alti si riscontrano nei trattamenti con e senza fattori di crescita e con i fattori di crescita coniugati al polimero A2-1. Tabella 1: tassi di crescita o decrescita del contenuto di glicosaminoglicani nella cartilagine trattata, nei quattro punti di riferimento temporali. Giorni Tasso di crescita/decrescita di GAG in % rispetto al controllo NO FC FC A2-1mix A2-1coniug A5-2mix A5-2coniug 3 123 150 -20 27 -16 -37 7 177 137 -25 55 56 -8 14 190 203 18 46 -30 -18 21 60 102 94 46 40 8 Tabella 2: tassi di crescita o decrescita del contenuto di collagene nella cartilagine trattata, nei quattro punti di riferimento temporali. Giorni Tasso di crescita/decrescita di idrossiprolina in % rispetto al controllo NO FC FC A2-1mix A2-1coniug A5-2mix A5-2coniug 3 42 30 10 26 16 30 7 56 76 -10 20 54 60 14 81 80 32 37 23 26 21 44 19 44 62 31 36 Il livello di glicosaminoglicani rilasciati nel media durante la coltura è, come si può attendere, complementare al valore ottenuto dalla cartilagine digerita. Invece, il quantitativo di idrossiprolina, indicativa del livello di collagene, nel media è risultato non sufficiente per poter essere letto: questo significa che tutto il collagene prodotto viene mantenuto all’interno della cartilagine. IV. Discussioni e conclusioni L’analisi dei dati di modulo complesso permette di determinare la rigidità della cartilagine sotto diverse condizioni di carico. In particolare, i cicli di carico fisiologico e di impatto delle attività quotidiane possono essere rappresentati da test dinamici alle basse e alte frequenze. Alle alte frequenze il modulo complesso e la sua parte reale sono maggiori di quelli misurati alle basse frequenze. Infatti, questa manifestazione è dovuta al fatto che la maggior parte della componente idrostatica dello stress è sostenuta dal fluido. La cartilagine ha una eccellente proprietà lubrificante, dunque è desiderabile non perdere questa capacità quando vengono utilizzati i fattori di crescita per incrementare le proprietà meccaniche del tessuto. È considerato un buon risultato quando il coefficiente di attrito della cartilagine trattata non è significativamente maggiore di quello del controllo. Trattamento con fattori di crescita La rigidità della cartilagine trattata con fattori di crescita è risultata essere maggiore del controllo; quanto detto è valido solo dopo il terzo giorno di trattamento, portando a pensare che i fattori di crescita non abbiano un’azione immediata. Ci si aspetta che i materiali ad alta rigidità presentino un alto coefficiente di attrito. Invece, tutti i dati di attrito raccolti in questo gruppo di campioni erano vicini ai valori del controllo, se non talvolta inferiori. Trattamento con fattori di crescita miscelati ai polimeri La rigidità e il coefficiente di frizione misurati in questo set di campioni sono maggiori rispetto a quelli del set con i semplici fattori di crescita, già dopo il terzo giorno. Il polimero conferisce un’intrinseca rigidità ed essendo una macromolecola favorisce la lubrificazione. Il basso contenuto di glicosaminoglicani delude le aspettative, fondate sulla reologia, infatti questa carenza è compensata da un alto valore di GAG rilasciato nel media a causa dell’alto stress dei condrociti. Il contenuto di collagene, invece, era più alto del controllo ed era stabile durante tutto il periodo di osservazione, andando a giustificare le proprietà meccaniche. Trattamento con fattori di crescita coniugati ai polimeri I risultati trovati per questo gruppo di campioni hanno trend qualitativamente simili a quelli trovati per i campioni con fattori di crescita miscelati ai polimeri. Comunque, quantitativamente, essi hanno valori maggiori di rigidità: che la coniugazione col polimero migliora l’azione dei fattori di crescita. Per quanto riguarda l’attrito, la differenza nel legame chimico tra fattori di crescita e polimeri, rispetto al set precedente, fornisce migliori risultati: i coefficienti di attrito sono più bassi, anche se più alti di quelli delle cartilagini con i soli fattori di crescita. Infine, comunque tutti i valori sono paragonabili al controllo. Conclusioni L’obiettivo del lavoro era di indurre la maturazione della cartilagine articolare utilizzando combinazioni di fattori di crescita e polimeri, per intensificare l’azione dei semplici fattori di crescita. Per valutare il successo del trattamento idealizzato ci si è serviti di due approcci: un’analisi meccanica e una biochimica, ricercando anche la correlazione tra le due. Tutto lo studio è stato eseguito seguendo protocolli opportunamente sviluppati o adattati da esistenti reperiti in letteratura. Le prove reologiche sono state attuate al fine di osservare le proprietà viscoelastiche della cartilagine. Inoltre, sono stati eseguiti test di attrito per esaminare il comportamento superficiale della cartilagine. Questi due tipi di prova sono stati scelti con l’obiettivo di osservare come la combinazione di fattori di crescita con i polimeri sia in grado di migliorare la maturazione della cartilagine, con conseguente miglioramento della rigidità senza però perdere la capacità di possedere un basso coefficiente di attrito. È noto che tra tutti i componenti della cartilagine, la matrice di proteoglicani-collagene sia responsabile delle proprietà meccaniche. Infatti, le analisi biochimiche si sono concentrate sulla quantificazione dei glicosaminoglicani (costituenti dei proteoglicani) e del collagene. Nonostante la dispersione dei risultati dei saggi biochimici, il confronto tra le prove meccaniche e biochimiche ha chiaramente evidenziato che i fattori di crescita hanno un effetto benefico sul processo di maturazione della cartilagine e che i vettori polimerici possono migliorare il processo.