Studio integrato EEG-fMRI dei correlati emodinamici alle variazioni di potenza neuronale in banda alfa durante resting-state

Spontaneous brain activity contributes to the greatest part of brain energy expenditure (Biswal et al.,1995): it has been shown that spontaneous fluctuations are organized and represent the main contribute to the variance of cerebral activity (Raichle et al., 2006), moreover the energy consumption difference between resting-state and task execution is negligible (Raichle et al., 2007). To be precise, spontaneous activity includes all endogenous brain activities, a set of functions that are intrinsically executed without any external stimulation. This activity is usually named “resting-state”. During resting state, subject is awake and conscious, relaxed and without stimulations. During the last decade, resting state activity has been the main topic in a great number of studies, which tried to identify the brain networks in which it is originated. Recently, the development of multimodal acquisition techniques has allowed to integrate complementary data about cerebral functionality and to increase the spatial and temporal resolution of the single acquisition techniques. The simultaneous registration of electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance (fMRI) is really promising, as it combines the direct information on neuronal activity with excellent temporal resolution provided by the EEG with the knowledge of oxygenation changes with high spatial resolution provided by fMRI. Since its creation, the EEG technique (Caton; Berger,1929) has been considered the main non-invasive tool for studying electrical brain activity. EEG has been extensively applied both in clinics and research with different purposes, from the study of epilepsy (Hamandi et al., 2004) to the investigation of brain mechanisms underlying the different sleep stages (Stern et al., 2006). The EEG data have an excellent temporal resolution, of about microseconds, but suffer from the inverse problem (Michel et al., 2001), for which it is impossible to localize the neural generators of the electrical brain activity recorded at the scalp level. On the other hand, the fMRI technique has an optimal spatial resolution and is extended to the entire brain, at the detriment of a low temporal resolution, in the order of seconds. Moreover, fMRI allows the localization of brain areas that exhibit oxygenation changes, are only indirectly linked to modifications in neural activity. The fMRI technique is usually based on Blood Oxygenation Level Dependent contrast (BOLD), which is sensitive to local variations in oxyhaemoglobin and deoxyhaemoglobin concentration ratio (Ogawa et al., 1992). The introduction of fMRI has revolutionized the neuroscience field, giving the opportunity to analyze cerebral activity in vivo.. Given their complementary properties, simultaneous EEG-fMRI represents the most powerful non-invasive way to investigate brain functionality. It allows to analyse the link between neural and metabolic-vascular activity and it gives the chance to overcome the spatial-temporal limitation in resolution that each modality would have if considered separately. In the last years, the introduction of high resolution EEG has allowed to increase spatial resolution, but still the best solution to the inverse problem is provided by simultaneous EEG-fMRI, which has given the chance to overcome EEG and fMRI limitations, using the complementarity of the different approaches. The study of the resting state brain mechanisms can also benefit from EEG-fMRI integration. The study of spontaneous brain activity started from Berger in 1929 who discovered the “alpha rhythm”, i.e. the oscillations between 8-12 Hz recorded in the posterior part of the scalp during rest with eyes closed, which desynchronize as soon as the subject is involved in the exectution of a task. Starting from the 2000’s, different EEG-PET and EEG-fMRI studies have been conducted in order to identify the cerebral mechanisms originating the alpha rhythm. Goldman and colleagues (2000) together with Moosman and colleagues (2002) noticed that the BOLD thalamic activity had a positive correlation with the alpha rhythm recorded at the scalp level. They also pointed out an inverse correlation between the EEG power in the alpha band and the BOLD fluctuations in parietal-occipital areas, reflecting the scalp EEG topology. Laufs and colleagues (2003) suggested the existence of a clear inverse relationship between occipital alpha and the BOLD occipital signal. In the present thesis, simultaneous EEG-fMRI was used to investigate the fMRI haemodynamic correlates of the EEG alpha rhythm during resting state in a group of healthy subjects. The identification of brain regions that are involved in the alpha rhythm was followed by the study of the effective connectivity pattern within the network. The activation analysis was performed using a General Linear Model analysis, whereas the information flow across different brain areas was investigated using Granger Causality Analysis (GCA). In the first part of the analysis we show a positive correlation between the occipital alpha rhythm and the central mu rhythm, which has given us the chance to focus the EEG-fMRI analysis only on the occipital alpha rhythm. In each subject, the hemodynamic correlates of the EEG alpha rhythm are investigated using and EEG-informed fMRI approach, using the EEG power variation in the alpha band as an input for the General Linear Model (Fritson et al.,1995). The connectivity network was defined by parcelling the brain areas resulting from the group analysis, which are the regions involved in the alpha rhythm generation, into anatomical clusters. The effective connectivity pattern was evaluated on the so-defined network. Materials and Methods EEG-fMRI data were simultaneously recorded from 22 healthy subjects at the Scientific Institute IRCCS E. Medea (Bosisio Parini, LC, Italy). The EEG acquisition was performed using a cap with 63 cerebral electrodes and one electrode for the measurement of the electrocardiogram (ECG). The EEG system, which was MR-compatible, was located inside the 3T MR scanner. During the EEG-fMRI acquisition, which lasted 8 minutes, the subject lied inside the scanner with the eyes closed in resting state. The gradient artifact (GA) and pulse artifact (PA) removal from the EEG recordings was performed using Brain Vision Analyzer 2.0 software. The pre-processing of fMRI data was performed using SPM12 Matlab toolbox and it consisted of the following steps: realignment, coregistration, normalization and smoothing. After EEG pre-processing, through in-house MATLAB scripts, we conducted a coherence analysis between the EEG signal from the occipital electrodes O1,02 and 0Z (Alpha occipital Rhythm) and the one from central electrodes C3,C4 (Cerebral mu Rhythm). The coherence was estimated using the AR spectral estimation (Baselli et al., 1987) applied to laplacians of the occipital and central EEG signals. We also applied the Wavelet Coherence Transform in order to show the time trend of coherence among the two signals. In order to analyze the hemodynamic correlates of alpha rhythm in resting state conditions we used SPM12, in particular we applied a data driven model based on prediction. The method used for the First Level Analyses is the General Linear Model (GLM): in this approach, the fMRI signal from each voxel is analyzed with a univariate test, in which the regressor representing the EEG power in the alpha band is used to forecast the BOLD signal trend in the corresponding voxel. The EEG regressor representing the changes in alpha power was obtained by applying the Continuous Wavelet Transform with a Morlet window. To model the BOLD response, the EEG power changes (averaged across the 8-12 Hz band) were convolved with the canonical Hemodynamic Response Function (HRF). After the GLM estimation, by by choosing the contrast we interrogated the model in order to extract the cerebral regions showing a positive/negative BOLD response to alpha power variations. After the first level analysis, we performed the group analysis based on a random effects analysis, in which the activation maps (SPM(t)) obtained from the single subject analyses were compared to generalize the results at the group level. The group significant region definition, called (ROIs), and BOLD signal extraction in the same areas was provided by GMAC and MARBAR toolboxes. By coregistration with Harvard Oxford atlas (http:// www.cma.mgh.hardvard.edu), we obtained the anatomical parcelation of the ROIs. The dimensional threshold of the anatomical clusters has allowed the selection of the most significant regions, which were used as nodes of the connectivity network. Connectivity analysis was performed by applying Granger Causality Analysis (GCA) to the BOLD time series of the network nodes. Results The coherence analysis between occipital and central EEG data has shown a local maximum between 8-12 Hz, letting us considering the two signals as correlates in that band. Due to the greater power of occipital alpha rhythm compared to central one, the former has been considered the main rhythm in resting state and used in the following EEG-fMRI analysis. EEG-fMRI group analysis has pointed out the presence of different cortical and subcortical area involved in alpha rhythm; in particular, a deactivation in occipital area and an activation in the thalamus emerged: this result is confirmed in other literature studies (Laufs et al., 2003,Goldman et al.,2000, Moosman et al., 2003). From the visual inspection of BOLD signal in the regions showing negative response (NBR (Negative BOLD Response)) and positive response (PBR (Positive BOLD Response)) to the EEG alpha power variation, it is possible to find confirmation of their correlation with the EEG regressor. The activation analysis results, after the anatomical parcelation and dimensional thresholding, point out a symmetry between the obtained regions, which have been used as network nodes for effective connectivity analysis. GCA results show the tendency of thalamic area to receive information from the rest of the network rather than to send it, creating the so called “sinks”. The role of “sink” of thalamic area hasbeen confirmed in two different effective connectivity analysis, at first considering separately the symmetric nodes in the two hemispheres and later putting them together. Discussion and conclusion From the coherence analysis between mu and alpha rhythms, we can hypothesize a concordance between the activation maps obtained using occipital and central electrodes, even if there are some physiological differences (Laufs et al., 2006). The group analysis of fMRI activations linked to the EEG alpha rhythm confirms on a larger dataset the results reported by (Moosman et al.,2003, Laufs et al., 2002 e Goldman et al.,2002), we confirmed the important role of the thalamus in spontaneous cerebral activity, as well as the occipital deactivation linked to the EEG alpha rhythm. The effective connectivity analysis based on GCA represents the main innovation of this thesis project. The results that show the role of the thalamus as a “sink” in the network is difficult to interpret and could require further analysis. However, these results confirm the key role of thalamic area in the cerebral mechanisms underlying spontaneous neural activity.

L’attività neuronale spontanea contribuisce alla gran parte della spesa energetica cerebrale (Biswal et al.,1995): infatti, le oscillazioni neuronali spontanee presentano un’organizzazione ben delineata costituendo un fattore rilevante per la varianza totale dell’attività elettrica cerebrale (Raichle et al.,2006), inoltre la differenza di consumo energetico cerebrale tra lo stato di riposo e l’esecuzione di un task è minima (Raichle,2007). L’attività spontanea, più precisamente, comprende l’insieme delle attività endogene del cervello, cioè quell’insieme di funzioni che vengono svolte intrinsecamente, senza la presenza di uno specifico stimolo esterno. Questo tipo di attività viene solitamente indicata col nome di “stato di riposo” o “resting-state”. Durante il resting state il soggetto appare vigile e cosciente, ma rilassato ed in assenza di stimoli; negli ultimi anni, l’attività cerebrale a riposo è stata oggetto di numerosi studi, aventi lo scopo di individuare le aree cerebrali nelle quali ha origine. Recentemente si è assistito allo sviluppo di avanzate tecniche di acquisizione multimodale, che hanno permesso di integrare informazioni complementari sulla funzionalità cerebrale e aumentare la risoluzione di indagine. La tecnica simultanea EEG-fMRI è particolarmente promettente, poiché permette di unire l’informazione neuronale ad alta risoluzione temporale della tecnica EEG con l’informazione sullo stato di ossigenazione ad alta risoluzione spaziale della tecnica fMRI. L’elettroencefalogramma (EEG) è stato lo strumento non invasivo principale per l’indagine dell’attività elettrica cerebrale a partire dalle origini (Caton; Berger,1929). L’EEG viene applicato in clinica a tematiche di ricerca molto differenti, dall’indagine dei meccanismi cerebrali alla base delle anomalie epilettiche (Hamandi et al., 2004) fino allo studio dei circuiti neuronali responsabili dei diversi stadi del sonno (Stern et al., 2006). I segnali EEG godono di un’eccellente risoluzione temporale, nell’ordine dei microsecondi, ma essendo registrati a livello dello scalpo soffrono del cosiddetto “problema inverso”, per cui è impossibile localizzare le sorgenti neuronali dell’attività elettrica registrata (Michel et al. 2001). L’fMRI presenta invece una risoluzione spaziale ottimale e permette la localizzazione delle aree cerebrali nelle quali vi è un cambiamento nello stato di ossigenazione, che viene a sua volta collegato a cambiamenti nel livello di attività neuronale. In particolare, la tecnica fMRI è generalmente basata sul contrasto detto Blood Oxygenation Level Dependent (BOLD), sensibile alle variazioni locali del rapporto tra ossiemoglobina e desossiemoglobina nel sangue (Ogawa et al.,1992).L’introduzione dell’fMRI come strumento di indagine dell’attività neuronale e metabolica ha rivoluzionato il campo delle neuroscienze fornendo la possibilità di effettuare un’analisi dell’attività cerebrale in maniera non invasiva ed in vivo. Tuttavia questa modalità di imaging presenta una bassa risoluzione spaziale, nell’ordine dei secondi. L’analisi multimodale simultanea di EEG-fMRI costituisce la più potente modalità non invasiva di investigazione della funzionalità del cervello, poiché permette di analizzare il legame tra attività neuronale e attività metabolica-vascolare, offrendo inoltre la possibilità di superare i limiti di risoluzione spazio-temporale che ognuna delle due modalità avrebbe se considerata separatamente. Negli ultimi anni, l’introduzione della modalità EEG ad alta risoluzione ha permesso di migliorare la risoluzione spaziale; La miglior soluzione al problema inverso è però stata fornita dalla registrazione combinata EEG-fMRI, che ha permesso il superamento delle limitazioni spaziali dell’EEG e di quelle temporali dell’fMRI, sfruttando la complementarietà dei singoli approcci. Lo studio dell’attività cerebrale spontanea ha inizio grazie a Berger, che nel 1929 chiamò “ritmo alfa” le oscillazioni tra 8-12Hz registrate nella parte posteriore dello scalpo durante la veglia a riposo del soggetto: esse subivano una desincronizzazione con l’aumento dello stato di veglia e lo svolgimento di tasks richiedenti particolare attenzione. A partire dagli anni 2000, diversi studi integrati EEG-fMRI ed EEG-PET sono stati coinvolti con l’obiettivo di identificare i meccanismi cerebrali responsabili del ritmo alfa. Goldman e colleghi (2002) insieme a Moosman (2003) notarono che l’attività BOLD a livello del talamo appare positivamente correlata con il ritmo alfa rilevato sullo scalpo e rilevarono inoltre la presenza di una correlazione inversa tra la potenza EEG in banda alfa e l’andamento del segnale BOLD nelle aree pareto-occipitali, che a loro volta riflette la topografia rilevata a livello dello scalpo. Laufs e colleghi (2003) confermano ulteriormente l’esistenza di una spiccata relazione inversa tra l’alfa occipitale e la diminuzione del segnale BOLD. Uno degli scopi di questa tesi è l’applicazione degli algoritmi di Statistical Parametrical Mapping volta all’indagine dei correlati emodinamici del ritmo alfa in resting state ed in secondo luogo lo studio della connettività effettiva tra le diverse aree cerebrali utilizzando la Granger Causality Analysis (GCA). Nella prima parte dell’analisi presentata in questo lavoro verrà mostrata la correlazione esistente tra ritmo alfa e ritmo mu negli elettrodi centrali, che ha permesso di concentrare l’analisi integrata EEG-fMRI sul ritmo alfa occipitale. Successivamente, si indagheranno i correlati emodinamici del ritmo alfa utilizzando un approccio EEG-informed fMRI, trasformando la variazione temporale di potenza in banda alfa del segnale EEG in un input per il General Linear Model (GLM) (Friston et al., 1995). In seguito alla parcellizzazione anatomica delle aree risultanti, ovvero le regioni coinvolte nella generazione del ritmo alfa, si procederà con lo studio della connettività effettiva all’interno della rete. Materiali e Metodi Il dataset EEG-fMRI (ElectroEncephaloGraphy/Functional Magnetic Resonance Imaging) è stato registrato da 22 soggetti sani presso l’IRCCS E. Medea (Bosisio Parini, LC). Per l’acquisizione si è fatto uso di un sistema di rilevazione EEG dotato di cuffia con 63 elettrodi EEG e un elettrodo elettrocardiografico (ECG) compatibile con l’ambiente di Risonanza Magnetica, posizionato all’interno di uno scanner MR a 3T.Il protocollo sperimentale prevede che il soggetto resti all’interno dello scanner per un tempo pari a 8 minuti in stato di veglia a riposo e con gli occhi chiusi. La rimozione degli artefatti da gradiente RM (Gradient Artifact (GA)) e da pulsazione (Pulse Artifact (PA)) dai segnali EEG è stata effettuata con il software Brain Vision Analyser 2.0. La pre-elaborazione dei dati fMRI è stata effettuata con il toolbox di MATLAB SPM12 ed è consistita nei seguenti passaggi: riallineamento, coregistrazione, normalizzazione e smoothing. Successivamente al preprocessing attraverso appositi script in MATLAB si è proceduto con l’analisi di coerenza in banda alfa tra il segnale EEG relativo alle derivazioni O1, O2, OZ (ritmo alfa occipitale) e quello relativo agli elettrodi C3, C4 (ritmo mu centrale), che ha permesso l’adozione del solo ritmo alfa occipitale in qualità di ritmo dominante nel corso dell’attività cerebrale spontanea. Per analizzare la coerenza si è applicata la stima spettrale dei modelli autoregressivi (Baselli et al., 1987) applicata ai modelli AR multivariati dei Laplaciani dei segnali EEG medi nelle relative derivazioni. Successivamente è stata applicata la Wavelet Coherence Transform, in modo da mostrare l’andamento nel tempo della coerenza tra i due segnali. Per l’analisi dei correlati emodinamici del ritmo alfa in condizioni di resting state si è utilizzato il software SPM12 ed in particolare è stato applicato un modello data driven basato sulla previsione. Il metodo utilizzato per l’analisi di primo livello (First Level Analysis) è il General Linear Model (GLM): si tratta di un test univariato nel quale il regressore EEG che rappresenta la potenza in banda alfa nel tempo è stato utilizzato per prevedere gli andamenti del segnale BOLD nelle mappe fMRI. L’ estrazione della potenza in banda alfa per l’ottenimento del regressore è stata resa possibile dall’applicazione della Continuos Wavelet Tranform (CWT) con finestra di Morlet. I risultati sono stati poi convoluti con la risposta emodinamica canonica (Hemodynamic Response Function, HRF). Mediante la scelta dei contrasti è possibile interrogare il modello in maniera da poter evidenziare le regioni cerebrali con risposta BOLD positiva/negativa alle variazioni di potenza alfa. A valle dell’analisi di primo livello è stata svolta l’analisi di gruppo (detta anche analisi di secondo livello) con un approccio basato sulla Random Effects Analysis, nel quale le mappe di attivazione (SPM(t)) derivanti dall’analisi di primo livello vengono utilizzate per generalizzare le inferenze dei singoli individui a livello di gruppo. La definizione delle regioni significative a livello di gruppo, dette regioni di interesse (ROIs), e l’estrazione del segnale BOLD nelle stesse è stata resa possibile dall’utilizzo dei Toolbox di Matlab GMAC e MARSBAR. Effettuando la coregistrazione delle ROI con l’atlante di Harvard-Oxford (http:// www.cma.mgh.hardvard.edu) è stata ottenuta la parcellizzazione anatomica delle aree attive. La sogliatura dimensionale delle aree ha permesso la selezione delle regioni più significative, che sono state utilizzate come nodi nella rete di connettività. L’analisi di connettività si è svolta grazie all’applicazione della Granger Causality Analysis (GCA) sulle serie numeriche BOLD estratte nelle aree risultanti. Risultati L’analisi di coerenza tra segnale occipitale e centrale ha mostrato un massimo locale tra 8-12Hz, consentendoci di considerare i due ritmi correlati. Data la maggiore potenza del ritmo alfa occipitale, quest’ultimo è stato considerato ritmo principale in condizioni di resting state ed è stato oggetto dell’analisi EEG-fMRI. L’analisi EEG-fMRI a livello di gruppo ha evidenziato la presenza di diverse aree corticali e sottocorticali coinvolte nel ritmo alfa, in particolare una deattivazione in zona occipitale ed una attivazione in sede talamica, risultati che trovano riscontro nella letteratura precedente (Laufs et al., 2003,Goldman et al.,2000, Moosman et al., 2003). Dall’osservazione dei segnali BOLD estratti nelle regioni di interesse con risposta negativa (NBR (Negative BOLD Response)) e positiva (PBR (Positive BOLD Response)) alle variazioni di potenza EEG alfa, si trova conferma della correlazione con il regressore EEG emersa dall’analisi statistica. I risultati dell’analisi di attivazione, a seguito di parcellizzazione anatomica e sogliatura dimensionale, evidenziano una simmetria tra le regioni ottenute, che sono poi state utilizzate come nodi della rete per l’analisi di connettività effettiva. I risultati della GCA mettono in luce la tendenza delle aree talamiche a ricevere più informazione di quanta ne immettano nella rete, costituendo quindi dei “pozzi” (sink). Il ruolo di “pozzo” dell’area talamica è confermato dalla concordanza degli esiti delle due analisi di connettività effettiva, considerando i nodi dapprima separatamente ed in seguito in maniera congiunta sui due emisferi. Discussione e Conclusione L’analisi di coerenza tra ritmo mu e alfa evidenzia come sia possibile in linea di principio ottenere una concordanza tra le mappe di attivazione sia considerando gli elettrodi occipitali, sia quelli centrali seppur con alcune differenze fisiologiche (Laufs et al., 2006). L’analisi di gruppo conferma su un dataset più ampio i risultati di Moosman et al.,2003, Laufs et al .,2002 e Goldman et al .,2002 , sottolineando l’importanza del ruolo del talamo nell’attività cerebrale spontanea e confermando la deattivazione in zona occipitale associata al ritmo alfa. L’analisi di connettività effettiva svolta con la GCA rappresenta il principale contributo innovativo di questo lavoro di tesi. Il risultato secondo cui il talamo si comporta come “pozzo” della rete appare di difficile interpretazione e richiede ulteriori verifiche. Tuttavia emerge anche in questo caso il suo ruolo chiave nei meccanismi cerebrali che sottendono l’attività neuronale spontanea.