Calcium imaging by light sheet fluorescence microscopy

Over the last decades there has been an impressive progression in optical microscopy to explore fundamental issues in life science. The understanding of complex phenomena like the mechanisms of calcium signalling requires a multiscalar method, to be applied from cells to organs in physiological condition, with minimum damage for the sample. An innovative approach for the field was provided by Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), a technique that introduces optical sectioning in wide-field microscopy. In the following work, an overview of the main calcium pathways is presented, along with a review of fluorescence probes for calcium imaging. This is followed by the description of the theoretical basis and the design features of three LSFM systems: a Selective Plane Illumination Microscope (SPIM), a Digital Scanned laser Light sheet based fluorescence Microscope (DSLM) and a two-photon DSLM. The first system was employed in the study of Arabidopsis plant roots in the context of improving the growth of crops and their tolerance to stresses. Fingerprints of calcium signalling related to the application of specific stimuli were observed across the whole plant root, for extended periods of time, with single cell resolution and low photodamage. Spontaneous calcium oscillations in root hairs were correlated to their growth by tree-dimensional screenings and validated by the analysis of knockout mutants showing growth issues. The DSLM was used for neuroimaging in the study of spontaneous activity in the brain of zebrafish larva. Spontaneous activity could be recorded at high frame rate and for many hours, over different brain areas, with neuronal resolution. This provided insights on the activity patterns of neurons and on the possibility of predicting behavioural effects of the fish. Two-photon excitation was instead implemented to observe visually evoked responses and understand how visuomotor behaviours are processed.

Negli ultimi decenni si è assistito ad un’impressionante evoluzione nel campo della microscopia ottica per le scienze della vita. La comprensione di fenomeni complessi come la trasmissione e codifica dei segnali del calcio richiede un approccio multiscala, che permetta l’osservazione di singole cellule all’interno di organismi in condizione fisiologiche e con minimo danno per il campione. In questo ambito, un metodo innovativo è stato introdotto dalla microscopia a foglietto di luce (Light Sheet Fluorescence Microscopy o LSFM), una tecnica che aggiunge il sezionamento ottico all’interno della microscopia a campo esteso. Nel presente lavoro si presentano in primo luogo i principali canali e meccanismi coinvolti nelle dinamiche del calcio. Si riportano inoltre i più importati sensori del calcio per microscopia di fluorescenza. Segue una descrizione delle basi teoriche della tecnica LSFM, con particolare attenzione per le caratteristiche delle tre implementazioni utilizzate per le sperimentazioni: i) Selective Plane Illumination Microscope (SPIM); ii) Digital Scanned laser Light sheet based fluorescence Microscope (DSLM); iii) DSLM con eccitazione a due fotoni. Il primo sistema è stato costruito per lo studio delle radici di una pianta, Arabidopsis thaliana, nel contesto del miglioramento della resa dei raccolti e della resistenza delle piante agli stress. Ciò ha portato all’osservazione nella radice di risposte del calcio caratteristiche dell’applicazione di specifici stimoli. Tale indagine è stata svolta per lunghi periodi di tempo (da minuti a ore), con risoluzione di singola cellula e minimo danno per il campione. Questo ha reso possibile l’analisi tridimensionale di oscillazioni spontanee nei peli radicali, in cui le variazioni del calcio sono state correlate con la loro crescita. I risultati sono stati validati dall’analisi di piante mutanti. Il secondo e terzo sistema sono stati impiegati nello studio delle attivazioni neuronali nel cervello di larve di zebrafish. Il DSLM è stato utilizzato per l’osservazione delle attivazioni spontanee di neuroni, acquisite ad alta frequenza e per molte ore simultaneamente in diverse aree del cervello e con risoluzione neuronale. Questo ha permesso l’analisi di nuovi pattern di attivazione e la possibilità di predire specifici comportamenti dell’animale. L’eccitazione a due fotoni è stata infine implementata per osservare risposte cerebrali evocate da stimoli visivi e comprendere come i comportamenti optomotori sono processati dal cervello.