Caratterizzazione meccanica e microstrutturale di scaffolds poliuretanici per tessuto cardiaco

Heart diseases are the leading cause of mortality in the world, being responsible for the 30% of the worldwide deaths. They are often a consequence of the aging process, which inevitably affects the human body, leading to a degeneration of all tissues, including the myocardium. This degeneration results in the alteration of both tissue structure and its mechanical, physical and chemical properties, with a consequent loss of functionality. For this reason, it is crucial to understand the senescence process and the effects that this entails on the properties and functionality of the myocardial tissue with the purpose to improve the treatments of human cardiac pathologies associated with it. This is the aim of the national scientific research project MIND (Engineering physiologically and pathologically relevant organ Models for the INvestigation of age related Diseases), which involves the construction of biomimetic scaffolds that reproduce the morphological, chemical and mechanical properties of the cardiac ECM, at two different levels of aging: healthy young tissue and aged tissue. Indeed, these scaffolds will be populated with cardiac cells, and cultured in bioreactors ad hoc designed able to reproduce in vivo conditions. These in vitro culture models allow both to reduce animal experimentation, generally employed in the preclinical screening stages during the development of new drugs, and to study the human senescence process involving the heart tissue. The thesis here presented plays a specific role within the MIND project, which is the morphological and structural characterization, at the microscale, and mechanical charatcterization, at the macroscale, of the scaffolds representing the two types of tissue: Young scaffolds and Aged scaffolds. At the Politecnico di Tornino, both the scaffolds and the solid films of the material forming the respective solid phases, PolyUrethane (PU), were made; the first ones by TIPS (Thermally Induced Phase Separation), and the second ones by hot pressing. The PU is a polymer whose physical, chemical and mechanical properties can be tailored according to the purpose, through the choice of suitable reagents and the selection of proper polymerization process parameters. Both for the Young case and for the Aged one, the PU was obtained using the same reagents, but with different molar ratios, in order to obtain a constituent matrix characterized by mechanical properties suitable to represent the two purposes. In fact, the degeneration process associated with aging mainly involves an increase in the tissue stiffness with respect to the young tissue. The morphological-structural analysis was conducted by using a confocal laser scanning microscope. The characteristic parameters of the scaffolds’ internal microstructure were estimated along the axial and transverse directions. From this analysis, it emerged that, along the axial direction, the Aged scaffolds have shown a higher porosity (71%) than Young scaffolds (24%), while along the transverse direction the porosity values obtained for the Aged scaffolds (23 %) are lower than those obtained for the Young scaffolds (37%). In both cases, and in both directions, non-circular pores have been identified, with dimensions in the order of 60-70 microns. This analysis was completed with the evaluation of the solid phase’s wall thickness: along both directions, thickness in the order of 10 μm was estimated for the walls of Young scaffolds, while for the walls of Aged scaffolds thikcness around 6 μm was found. As regards the mechanical characterization, nanoindentation tests on films representing the Young and Aged matrices were first conducted. These tests have shown a greater stiffness of the material constituting the solid phase of the Aged scaffolds (Er = 51.39 MPa) compared to that constituting the solid phase of the Young scaffolds (Er = 18.08 MPa), highlighting in this way the goodness of the two different PU’s polymerization process. These tests are followed by microtensile tests (μTM), which have, however, revealed an undifferentiated mechanical response of the two types of scaffolds, with the Young modulus E = 1 MPa in both cases, although the Aged matrix is stiffer than the Young one. This result is a consequence of the greater porosity and smaller thickness of the walls that characterize the Aged scaffolds along the axial direction than that of Young scaffolds. Despite this, since the PU constituting the scaffolds’ matrices are constitutionally different, the Aged constructs showed a higher tensile strength, with higher values of the yield strength and maximum stress. Microcompression tests (μCM) were performed, both in dry and liquid environment, which showed that in dry conditions young and aged scaffolds exhibited statistically the same stiffness; whereas, in liquid tests, the Aged scaffolds showed a compressive stiffness equal to that estimated in dry conditions and twice than that of the Young samples. It is assumed that in this last case the water is adsorbed more easily within the structures of the scaffolds altering their properties. To conclude the experimental section, dynamic-mechanical tests have been conducted, which have revealed, in both cases, the predominance of an elastic behavior over the viscous one, a storage modulus numerically close to the Young modulus obtained in the μTM tests and 65% higher, in the case of Young scaffolds, than that achieved for Aged scaffolds (although the Aged matrix is stiffer than the Young one), confirming the fact that it is the internal microstructure of the scaffolds that plays a predominant role in the mechanical response to external stresses. The whole work ends with the identification of the smallest window of observation, along the axial and transverse directions for the two different types of scaffolds, through Matlab codes that process the images obtained with the Lext-OLS4100 and previously used for the morphological analysis, and with the consequent definition of the dimensions of the representative volume element for the two types of constructs to be used in a possible finite element modeling.

Le malattie cardiache sono la principale causa di decesso nel mondo, alle quali sono imputabili il 30% delle morti totali. Spesso, sono conseguenza del processo di invecchiamento che colpisce inevitabilmente il corpo umano, portando ad una degenerazione dei tessuti, e quindi anche del miocardio. Tale degenerazione comporta l’alterazione di struttura, proprietà meccaniche, fisiche e chimiche del tessuto in questione con conseguente perdita di funzionalità. Per questo motivo, risulta essere di fondamentale importanza la comprensione del processo di senescenza, gli effetti che questo comporta sulle proprietà e sulla funzionalità del tessuto miocardico, e lo studio e il trattamento delle patologie cardiache umane ad esso associate. Questo è lo scopo del progetto di ricerca scientifica nazionale MIND (Ingegnerizzazione di Modelli d’organo di interesse fisiologico e patologico per l’INdagine di Disturbi legati all’invecchiamento), il quale prevede la realizzazione di scaffolds biomimetici che riproducano le caratteristiche morfologiche, chimiche e meccaniche della ECM cardiaca, a due differenti livelli di invecchiamento: tessuto giovane sano e tessuto invecchiato. Tali scaffolds saranno infatti popolati con cellule cardiache, e coltivati in bioreattori progettati ad hoc in grado di riprodurre fedelmente le condizioni in vivo. Questi modelli di coltura in vitro consentono sia di ridurre la sperimentazione animale, impiegata generalmente nelle fasi screening preclinico durante lo sviluppo di nuovi farmaci, sia di studiare il processo di senescenza umano che coinvolge il tessuto cardiaco. Il lavoro di tesi qui presentato riveste un ruolo specifico all’interno del progetto MIND, ed è quello della caratterizzazione morfologico-strutturale, alla microscala, e meccanica, alla macroscala, degli scaffolds rappresentanti le due tipologie di tessuto: scaffolds Giovani e scaffolds Invecchiati. Presso il Politecnico di Torino, sono stati realizzati sia gli scaffolds, mediante TIPS (Separazione di Fase Termicamente Indotta), sia, attraverso lo stampaggio a caldo, i films del materiale costituente le rispettive fasi solide, il poliuretano (PU). Il PU è un polimero le cui proprietà fisiche, chimiche e meccaniche sono modellabili in funzione dello scopo, attraverso la scelta di reagenti opportuni e la modifica dei parametri del processo polimerizzazione. Sia per il caso Invecchiato che per quello Giovane, il PU è stato ottenuto impiegando i medesimi reagenti, ma con rapporti molari diversi, di modo da ottenere una matrice costituente caratterizzata da proprietà meccaniche idonee ai due scopi. Infatti il processo di degenerazione legato all’invecchiamento comporta principalmente un aumento nella rigidezza del tessuto e minore flessibilità, condizione che gli scaffolds cardiaci Invecchiati devono riprodurre rispetto a quelli Giovani. L’analisi morfologico-strutturale è stata condotta mediante l’utilizzo di un microscopio confocale a scansione laser. Sono stati stimati i parametri caratteristici della microstruttura interna degli scaffolds, lungo la direzione assiale e trasversale. Da questa analisi è emerso che, lungo la direzione assiale, gli scaffolds Invecchiati hanno mostrato una porosità superiore (71%) rispetto a quella degli scaffolds Giovani (24%), mentre lungo la direzione trasversale i valori di porosità ottenuti per scaffolds Invecchiati (23%) risultano essere inferiori di quelli degli scaffolds Giovani (37%). In entrambi i casi, e in entrambe le direzioni, sono stati identificati pori non circolari e di dimensioni nell’ordine dei 60-70 μm. Tale analisi si è conclusa con la valutazione degli spessori di parete della fase solida: lungo entrambe le direzioni, si sono valutati spessori nell’ordine dei 10 μm per le pareti degli scaffolds Giovani, e 6 μm per le pareti degli scaffolds Invecchiati. Per quanto concerne la caratterizzazione meccanica, si sono per prima cosa condotte prove di nanoindentazione sui films rappresentanti la matrice Giovane ed Invecchiata. Queste prove hanno evidenziato una maggiore rigidezza del materiale costituente la fase solida degli scaffolds Invecchiati (Er=51.39 MPa) rispetto a quello costituente gli scaffolds Giovani (Er=18.08 MPa), evidenziando quindi la bontà del processo di polimerizzazione per i due differenti PU. A queste prove, sono seguiti test di microtrazione (μTM), i quali hanno però evidenziato una risposta meccanica dei due tipi di scaffolds indifferenziata, con modulo di Young E=1 MPa in entrambi i casi, sebbene la matrice Invecchiata sia più rigida di quella Giovane. Questo risultato è conseguenza della maggiore porosità e minor spessore delle pareti che caratterizzano gli scaffolds Invecchiati lungo la direzione assiale rispetto a quelli Giovani. Nonostante questo, essendo i PU costituenti la matrice degli scaffolds costituzionalmente diversi, i costrutti Invecchiati hanno mostrato una maggiore resistenza alla trazione, con valori di sforzo di snervamento e sforzo massimo superiori. Sono state poi condotte prove di microcompressione (μCM), a secco e in liquido, da cui è emerso che, mentre nelle prove condotte in ambiente secco, gli scaffolds hanno mostrato la medesima rigidezza (risultato sempre dovuto alle differenti porosità e diversi spessori di parete tra scaffolds Giovani ed Invecchiati), nelle prove in liquido, gli scaffolds Invecchiati hanno mostrato una rigidezza a compressione pari a quella stimata a secco e doppia di quella dei campioni Giovani; si presume che in quest’ultimo caso l’acqua riesca a penetrare più facilmente all’interno delle strutture dei costrutti alterandone le proprietà. Per concludere la parte dei test sperimentali, si sono condotte prove dinamico-meccaniche, le quali hanno evidenziato, in entrambi i casi, la predominanza di un comportamento elastico su quello viscoso, uno storage modulus numericamente vicino al modulo di Young ottenuto nelle μTM e superiore, nel caso di scaffolds Giovani, del 65% rispetto a quello ottenuto per scaffolds Invecchiati (sebbene la matrice Invecchiata sia più rigida di quella Giovane), a conferma del fatto che è la microstruttura interna degli scaffolds a giocare un ruolo predominante nella risposta meccanica a sollecitazioni esterne L’intero lavoro si conclude con l’identificazione della più piccola finestra d’osservazione, nelle direzioni assiale e trasversale per le due diverse tipologie di scaffolds, attraverso codici Matlab che processano le immagini ottenute con il LEXT-OLS4100 e precedentemente utilizzate per l’analisi morfologica, e con la conseguente definizione dei volumi delle celle elementari rappresentative le due tipologie di costrutti da utilizzarsi in un’eventuale modellazione agli elementi finiti.