Live imaging and analysis of the embryonic heart to study tissue dynamics and calcium signaling in cardiogenesis

Congenital cardiovascular diseases are structural problems that form when the cardiac morphogenetic process is altered. In the hope that one day early diagnosis and cure of these conditions will be possible, many researches are trying to understand why and how cardiogenesis is impaired. In this context, the present work aims to study the embryonic heart in zebrafish model at early developmental stages in vivo. Zebrafish model offers several advantages in cardiovascular research: genetic tools are available to overexpress or knock down genes involved in cardiogenesis; the heart mechanics can be perturbed in vivo to study its effect on cardiac morphogenesis and the transparency of the embryos allows high resolution live imaging. The analysis presented in this thesis is based on the data acquired from four-dimensional live imaging of the beating heart and considers the dynamics of the three layers composing the heart at these initial developmental stages (myocardium, endocardium and cardiac jelly), the velocity of red blood cells along the heart and the calcium dynamics in the myocardium. This represents the first step to understand the working mechanism of the primitive valveless heart and allows to study the electromechanical coupling in the heart. The analysis, performed on healthy embryos, corresponds to the starting point for the study of pathological conditions. The same analysis could be conducted in the future on hearts affected by genetic or physical alterations to understand how these anomalies impact on the anatomy and on the normal working mechanism of the heart.

I difetti congeniti del cuore sono alterazioni della struttura e della funzione cardiaca che nascono quando il normale processo di sviluppo del cuore viene compromesso. Nel tentativo di sviluppare tecniche di diagnosi precoce e di cura di queste condizioni, molti sforzi sono attualmente rivolti allo studio della cardiogenesi e dei processi che possono alterarla. In questo contesto, il presente lavoro si pone come obiettivo lo studio in vivo del cuore dell’embrione nelle prime fasi di sviluppo usando lo zebrafish come modello animale. Lo zebrafish è un organismo ideale nella ricerca cardiovascolare grazie all’ampia gamma di tecniche genetiche attualmente disponibili che permettono di aumentare o bloccare l’espressione di geni fondamentali nel processo di sviluppo del cuore e di alterare la biomeccanica del cuore in vivo per indagarne il ruolo nella cardiogenesi. La trasparenza ottica degli embrioni, inoltre, rende possibile l’uso di tecniche di imaging in vivo ad alta risoluzione. L’analisi presentata in questa tesi si basa sui dati ottenuti dall’imaging del cuore battente e comprende lo studio, per mezzo di algoritmi sviluppati ad hoc, della dinamica dei tre strati che compongono il cuore nelle iniziali fasi di sviluppo (miocardio, endocardio e cardiac jelly), della velocità dei globuli rossi e della propagazione dell’impulso elettrico. Oltre a permettere uno studio preliminare del meccanismo di funzionamento del cuore, con i metodi sviluppati è possibile indagare l’accoppiamento elettromeccanico del cuore. L’analisi, condotta su campioni sani, vuole essere un punto di partenza nello studio di condizioni patologiche. Gli stessi algoritmi e protocolli sperimentali sviluppati in questa tesi potranno essere applicati in futuro su cuori affetti da alterazioni genetiche o fisiche per capire come queste anomalie influenzino l’anatomia e il normale funzionamento del cuore.