Polymeric nanoparticle system to target activated microglia macrophages in spinal cord injury

Spinal cord injury is one of the most diffuses causes of non-congenital motoric disability. The lesion is the result of mechanical trauma that compresses or cut the spinal cord, interrupting the normal nervous signalling. The injury presents two phases, primary and secondary. Primary injury is the acute phase, when damage occurs and inflammation and haemorrhaging rise worsening envi-ronmental conditions for the survived cells. In the secondary phase there is further apoptotic cell death, demyelination and formation of cyst and glial scar which inhibit neurologic regeneration. Little can be done for primary injury, treatments are focused on limiting secondary injury related damages, reducing inflammation state and scar formation. In particular inflammation seems to be a good target for therapeutic treatments aimed at improving functional recovery. The reduction of inflammation using anti-inflammatory drugs, which promote switching of macrophage and glial cells from the pro-inflammatory activated state (M1), can im-prove SCI prognosis. However traditional administration of anti-inflammatory drugs is too much dispersive, causing over-dosages, accumulation in non-targeted organs and low efficacy. Nanotechnology raises increasing interest in the scientific community because of the continued syn-thesis techniques refinement, which lead to create complex nanostructures able to perform multiple tasks in pharmacological and biomedical applications. Among the many possible applications the drug loading is one of the most interesting, allowing to bring drugs to target organs without losses in the body and thus reducing the administered doses. The aim of this study is to create, characterize and test a nanovector-mediated drug delivery system that allows to bypass the problems connected to traditional drug administration ways and to im-prove efficacy and targeting. At this purpose biocompatible polymeric nanoparticles with monodispersed size have been synthe-sized. The base monomers are 2-hydroxyethylmethacrylate (HEMA) associated with poly-ε-caprolactone (PCL), rhodamine B (RhB) and poly(ethyleneglycol) (PEG). Poly-ε-caprolactone guarantees NPs degradation and ability to load hydrophobic drugs; rhodamine B works as fluorescent signal and al-lows NPs tracking while used in biological settings like cell culture or animal model; PEG gives a highly hydrophilic and biocompatible external surface to the polymeric nanoparticle. Synthetized nanoparticles have been characterized with Dynamic Light Scattering and Electron Transmission Microscopy (TEM) to confirm size, form and structure. The nanoparticles were loaded with hydrophobic anti-inflammatory drug (minocycline) and the loading percentage has been measured with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and mass spectroscopy. Once that the drug loading has been evaluated appropriate for the therapeutic goal, loaded and un-loaded NPs have been put in cell culture to verify biocompatibility/cytotoxicity, degradation me-chanic and time in physiologic conditions and drug release characteristics. The next sperimental step was to prove the selectivity: only microglial and macrophage cells had to uptake in great numbers the nanovectors, to grant treatment efficacy. Verified this point the experi-ment pass to the in vivo application phase. Murine animal model has at first been utilized. After spinal cord injury drug-loaded and unloaded nanoparticles have been injected at the moment of injury induction in various quantities to prove the real efficacy and the better treatment. The treatment efficacy was measured with behavioural tests like the Basso Mouse Scale (BMS), evaluating motor recovery of injured animals. Some functional recovery was seen in T0 treated an-imals, so the treatment has been tested at different times, 5 hours, 1, 2 and 7 days post injury, to see if there would be some improvement even with treatment delayed to injury, as would happen in the reality of a human cases application. Treatment efficacy was also investigated with other techniques: flow cytometry, immunohistochemistry and confocal microscopy.

La lesione del midollo spinale è solitamente causata da un evento traumatico che compromette la conduzione dei segnali motori e sensoriali a livello del sito di lesione causando importanti deficit neurologici e disfunzioni senso-motorie. Si stima che questo genere di traumi interessi, solo in Europa, circa 330.000 individui e i suoi effetti derivano da una serie di eventi. La lesione è caratterizzata da una fase primaria, conseguente al trauma meccanico, e da una fase secondaria multifattoriale costituita da sottofasi distinte temporal-mente in: immediata, acuta, subacuta, intermedia e cronica. La fase primaria è legata alla contusione, compressione o stiramento delle vie nervose ascendenti e discendenti lungo la colonna, mentre la fase secondaria riguarda l’infiammazione locale, la morte neuronale, la demielinizzazione, la formazione di una cicatrice gliale intorno il sito di lesione, in grado di generare una barriera fisica e produrre segnali chimici inibenti la rigenerazione assonale, e porta alla degenerazione post traumatica e all’instaurarsi di uno stato di dolore cronico. Numerose evidenze indicano che l'infiammazione acuta è una componente centrale della lesione del midollo spinale e contribuisce alla diffusione, amplificazione e cronicizzazione della lesione tissutale. La microglia attivata e i macrofagi periferici sono rilevati costantemente nel tessuto dopo la lesione e rappresentano la principale componente cellulare dell'infiammazione. Diversi studi sono stati condotti per comprendere il ruolo della microglia e dei macrofagi reclutati nel sito di lesione. Tali studi hanno evidenziato un effetto pleiotropico di queste cellule associato a due differenti fenotipi M1, pro-infiammatorio, e M2, antiinfiammatorio, che mostrano una precisa collocazione spazio-temporale all'interno del sito della lesione. Il ruolo dell'attivazione microgliale nel decorso della patologia, invece, risulta essere ancora contro-verso: da un lato risulta neurotossica a causa della produzione di molecole quali citochine e acido nitrico da parte di cellule attivate nel fenotipo M1, dall’altro sembra avere un ruolo benefico (feno-tipo M2) grazie al rilascio di fattori neuroprotettivi quali citochine anti-infiammatorie e fattori neu-rotrofici. L’obiettivo di una terapia curativa è, perciò, quello di evitare la risposta infiammatoria dannosa e promuovere la risposta rigenerativa: ciò può essere realizzato con l’ausilio di farmaci, sostanze pro-tettive o fattori di crescita a supporto di cellule appropriate. Abbiamo deciso di concentrarci sull’approccio farmacologico e abbiamo quindi creato e caratteriz-zato un sistema farmacologico a rilascio controllato (nanoparticelle a base di PCL (poli-ε-caprolattone) e PEG (polietilenglicole), denominante NPs) in grado di trattare selettivamente la mi-croglia e i macrofagi, con lo scopo di spiegare il coinvolgimento delle cellule microgliali che con-tribuiscono alla risposta pro-infiammatoria dopo la lesione al midollo spinale. Come farmaco antiinfiammatorio è stata scelta minociclina per la sua già provata efficacia nel ridurre lo stato di infiammazione e prevenire la morte di neuroni e astrociti attorno al sito di lesione dopo una lesione al midollo spinale. Abbiamo sintetizzato il macromonomero di cui sono composte principalmente le NPs con un pro-cesso di polimerizzazione ad apertura di anello sfruttando l’anello del caprolattone (CL), partendo da HEMA (2-idrossietil metacrilato) e usando Sn(Oct)2 come catalizzatore. È stata scelto di creare un macromonomero con 3 unità di CL e di farlo reagire con HEMA-PEG19, commercialmente di-sponibile, mediante polimerizzazione radicalica in emulsione in modalità semi-batch usando KPS come iniziatore e Tween80 come tensioattivo. Le NPs sono state caratterizzate con DLS e TEM per verificare che il diametro fosse compreso tra 100 e 130 nm e che l’Indice di Polidispersità (PDI) fosse ragionevolmente basso. Stessi controlli sono stati fatti dopo 48h di incubazione in condizioni fisiologiche e dopo il caricamento con il far-maco antiinfiammatorio prescelto, minociclina free-base, riscontrando poca variabilità sia nelle di-mensioni che nel PDI. Il caricamento della minociclina all’interno delle NPs è stato effettuato sfruttando la natura idrofo-bica del farmaco, che lo porta a preferire l’ambiente alifatico costituito dal core delle NPs piuttosto che la soluzione acquosa circostante. Quindi contattando NPs e soluzione di minociclina all’interno degli stretti canali di un T-mixer siamo riusciti ad intrappolare all’interno delle NPs circa il 35 % del farmaco, risultato confermato dall’analisi combinata di cromatografia HPLC e spettrometro di massa. Abbiamo verificato su colture miste di cellule del sistema nervoso (neuroni, astrociti e microglia) la selettività delle NPs, confermando che l’internalizzazione avviene solo nelle cellule microgliali atti-vate con LPS fino ad arrivare ad una concentrazione di NPs nel citoplasma circa quindici volte su-periore a quella nel medium di coltura. Dopo l’internalizzazione e la digestione delle NPs non sono stati misurati peggioramenti nella vitalità e capacità di riproduzione della cellule sottoposte al trattamento, confermando la non-citotossicità delle NPs PEGilate. Abbiamo anche investigato sul meccanismo di internalizzazione, stabilendo, attraverso la sommini-strazione alle cellule di fattori inibenti, che avviene con un meccanismo di endocitosi clatrina-dipendente. Le cellule microgliali sottoposte a questo trattamento, sebbene attivate, non sono state in gradi di internalizzare le NPs. La degradazione delle NPs da parte delle cellule avviene nel giro di una settimana, permettendo un rilascio graduale del farmaco intrappolato man mano che le nanoparticelle vengono erose dagli en-zimi prodotti dai lisosomi che le hanno incorporate. È stata confrontata l’efficacia della somministrazione di minociclina caricata nelle NPs rispetto alla somministrazione tradizionale, ed è stato visto che il trattamento con NPs ha un’efficacia significa-tivamente maggiore nel ridurre lo stato infiammatorio della microglia attivata. Prove di somministrazione di sole NPs scariche o NPs scariche e minociclina non hanno dimostrato di essere in grado di modificare il fenotipo della microglia. Visti i buoni risultati ottenuti dalle prove in vitro siamo passati alle prove in vivo, effettuate su topi C57BL6/J e B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J; quest'ultimi presentano la sequenza codificante la Green Fluorescent Protein (GFP) posta sotto il controllo del promotore CX3CR1, esprimendo in questo modo la proteina fluorescente a livello della microglia. Dopo l’iniezione delle NPs direttamente nel parenchima di topi a cui era stata indotta una lesione per compressione al midollo spinale, è stato verificato che anche in un modello di infiammazione spontanea l’internalizzazione delle NPs avviene solo nelle cellule microgliali, come si è visto nella colocalizzazione delle NPs fluorescenti grazie alla rodamina B e della microglia fluorescente per espressione della GFP. Mediante analisi FACS delle cellule attorno alla lesione abbiamo anche dimostrato che l’internalizzazione da parte di macrofagi è minore di quella da parte di microglia. Abbiamo eseguito degli studi comportamentali e valutato, mediante analisi FACS, le cellule micro-gliali e macrofagiche M1/M2 presenti nell'epicentro della lesione di topi trattati con nanoparticelle caricate con minociclina (PCL-Mino). Somministrando PCL-Mino subito dopo l’induzione della lesione (T0) si ottiene un miglioramento nelle capacità motorie dei topi trattati, mentre nessun miglioramento significativo si misura in topi trattati con solo minociclina, solo NPs o con soluzione salina rispetto ai topi non trattati. Abbiamo infine provato a somministrare il trattamento con PCL-Mino a diversi tempi dopo l’induzione della lesione, cioè dopo 5 ore, un giorno e due giorni. Dall’analisi dei test comporta-mentali eseguiti filmando gli animali lasciati liberi in un’arena è risultato che, ancora una volta, il trattamento più promettente sembra essere quello eseguito al T0, che mostra un miglioramento a partire dal 21° giorno dopo la lesione che perdura per tutto il tempo del test (due mesi). In conclusione, il trattamento con PCL-Mino, se somministrato precocemente dopo la lesione, di-mostra di modulare efficacemente le cellule microgliali residenti riducendo il fenotipo attivato M1 e quindi la risposta pro-infiammatoria, mantenendo un ambiente protettivo e pro-rigenerativo e appor-tando un miglioramento significativo della funzione locomotoria rispetto al controllo negativo. Inoltre, abbiamo dimostrato che la microglia residente gioca un ruolo chiave nel reclutamento dei macrofagi periferici M1 durante la progressione della SCI, evidenziando un contributo deleterio da parte di questa popolazione nella fase precoce della lesione secondaria.