Modellazione computazionale e realizzazione di un bioreattore pulsatile per lo studio e l'ingegnerizzazione del tessuto cardiovascolare

Introduction Tissue engineering (TE) is configured today as one of the most innovative techniques for the treatment of conditions affecting the cardiovascular system diseases. With the aim of regenerating the damaged autologous tissue, TE uses devices called bioreactors to ensure appropriate stimulation of autologous cells (adult stem cells or iPS) grown on a 3D physical support called scaffolds whereby, at the end of the growth, form functional cellular construct which will be implanted in the donor patient. The devices currently used in clinical research gave to the cells mainly mechanical stimuli (biaxial stretch) and fluid flow stimuli (shear stress). The effects of these stimulations are often analyzed retrospectively with rough evaluation. The present work fits into this background and it aims to design and develop of a cardiovascular tissue bioreactor through an innovative attitude based on computational models. This modelling allows an accurate prediction of the stimuli acting inside the colture chamber, but also a better interpretation of the results in rear. The strength feature of this bioreactor is the synchronous execution of two types of stimuli: • Scaffold biaxial stretch induced by hydrostatic pressure related to the flow, caused by a valve that block the culture chamber’s outlet; • Shear stress due to the laminar flow through the culture chamber. Moreover, managing the combined action of a pump and a valve by a control unit, it’s created a pulsatile flow mimicking in vitro cardiac cycle. Design and development of the device Thanks to the analytical model and especially to the next computational refinement, through the COMSOL Multiphysics software, the best structural solution of the culture chamber has been identified in oreder to reach both the pressure required to ensure an average biaxial deformation ranging 4-13% on the surface of the scaffold (silicone or cardiac patches), both the flow rate necessary to ensure a shear stress ranging 0.6-2.4 dyne/cm2. From all this analysis it appeared that the semi-ellipsoidal geometry is the most useful structural solution. It was therefore designed with 3D CAD software SolidWorks ® and built first as a prototype with 3D printing and finally to machine tools, following some changes dictated by experimental needs.The device is supported by a control unit managing the electromechanical actuators to create a pulsatile flow thus providing graphical interface that allows the user to set the stimulation parameters. The control unit managing on the software-hardware Arduino® platform, programmed with a code implementing the functions associated to the stimulation types. The functions written in the code are divided into blocks, making it easy to implement according to new requirements. Results and discussion Accoring to the results obtained we can state that the computational model leads to more detailed studies about complex geometries than the analytical one, also modeling the interaction between solid and fluid domain. Simulations performed on different scaffolds shows that flow rate range 60-100 ml/min it’s suitable to guarantee 4% ≤ εy ≤ 13%, furthermore flow rate range 70-90 ml/min ensures the largest area of the scaffold stimulated with 0.6 dyne/cm2 ≤ τ ≤ 2.4 dyne/cm2. By conducting experimental test it has benn proved the functionality of the control code and the hydraulic sealing. Furthermore, deformation photogrammetric analysis confirms the trend of the FSI model, so there’s a direct proportionality between pressure (static test) or flow rate (dynamic test) and the deformations. eformations values deriving from the two models prove that the results are comparable, although there are evaluation differences due to measurement errors caused by a non-optimal experimental set-up and by the approssimations introduced to analise the deformation; anyway those differences can be filled by appropriate correction factors. Conclusion The analytical model, despite some limitations, represents a valuable tool for introducing subsequent computational estimates. It guarantees a more precise prediction of the stimulation conditions inside the bioreactor, also confirmed by the experimental evidence of validation, despite the photogrammetric analysis was affected by errors due to the experimental set-up. However, these errors can be minimized by performing further experimental tests with dedicated micro strain gauges. Moreover, a complete post validation could be perfmored trough sterility, cytotoxicity/cytocompatibility test well as live imaging of the conditioning of different cell phenotypes. Overall, it can be stated that the predictive modeling, that precedes the realization of this pulsatile bioreactor, represents an innovative approach in TE because compared to the trial and error approach it optimizes the design stage saving of resources and allowing a more accurate prediction of the stimuli.

Introduzione L’ingegneria dei tessuti (TE) si configura ad oggi come una delle tecniche più innovative per il trattamento delle patologie a carico del sistema cardiovascolare. Con l’obiettivo di rigenerare il tessuto autologo danneggiato, la TE utilizza dispositivi chiamati bioreattori che provvedono all’opportuna stimolazione di cellule autologhe (staminali adulte o iPS) coltivate su un supporto fisico 3D chiamato scaffold con cui, al termine della crescita, formano un costrutto celluare funzionale che sarà poi impiantato nel paziente donatore. I dispositivi attualmente presenti in ambito clinico e di ricerca sfruttano principalmente stimoli meccanici (stretch biassiale) e fluidodinamici (shear stress) i cui effetti sono spesso analizzati a posteriori con valutazioni approssimative dell’effetto ottenuto. In questo scenario si inserisce il presente lavoro di tesi, il cui obiettivo è di progettare e realizzare un bioreattore per il tessuto cardiovascolare con un approccio innovativo basato su modelli computazionali che permettono una previsione molto precisa degli stimoli agenti nel bioreattore ed una miglior interpretazione dei risultati a posteriori. Il punto di forza del bioreattore sviluppato è la possibilità di attuare comtemporaneamente due tipi di stimoli:  Deformazione biassiale dello scaffold per effetto della pressione idrostatica del flusso, generata tramite una valvola che occlude l’outlet della camera di coltura;  Shear stress dovuto al flusso laminare che transita all’interno della camera di coltura. Inoltre, grazie all’azione congiunta di una pompa e di una valvola gestite da un sistema di controllo elettronico, è possibile ottenere un flusso pulsatile che mimi il ciclo cardiaco in vitro. Progettazione e descrizione del bioreattore sviluppato Grazie al modello analitico e soprattutto al successivo raffinamento computazionale, attraverso il software COMSOL Multiphysics, è stata individuata la miglior geometria della camera di coltura per raggiungere sia la pressione necessaria per garantire una deformazione media compresa tra il 4% e il 13% sulla superficie dello scaffold (silicone o patch cardiaca), sia la portata necessaria per garantire uno sforzo di taglio compreso tra 0.6 dyne/cm2 e 2.4 dyne/cm2. Da tutto ciò è emerso che la geometria semi-ellissoidale risulta la soluzione strutturale più vantaggiosa. È stata quindi disegnata con software 3D CAD SolidWorks ® e realizzata prima come prototipo con stampa 3D-print ed infine alle macchine utensili, a seguito di alcune modifiche dettate da necessità sperimentali.Il dispositivo si completa con un sistema di controllo che gestisce gli attuatori elettromeccanici i quali provvedono effettivamente alla creazione di un flusso pulsatile, ed è inoltre dotato di un’interfaccia grafica tramite cui l’utente imposta i parametri di stimolazione, in maniera user- friendly. Il controllo elettronico si basa sulla piattaforma software-hardware di Arduino®, programmata con un codice che implementa le funzioni associate alle tipologie di stimolazione. Le funzioni scritte nel codice sono suddivise in blocchi, risultando facilmente implementabili secondo nuove esigenze. Risultati e discussione Sulla base dei risultati ottenuti si può affermare che il modello computazionale, rispetto a quello analitico, ha la possibilità di condurre studi più accurati su geometrie complesse e di modellizzare l’interazione tra dominio solido e fluido. Dalle simulazioni effettuate su diverse tipologie di scaffold emerge che il range di portate 60-100 ml/min è sufficiente per garantire 4% ≤ εy ≤ 13%, inoltre il range 70-90 ml/min assicura la maggior porzione di area dello scaffold stimolata con 0.6 dyne/cm2 ≤ τ ≤ 2.4 dyne/cm2. Conducendo le prove su sperimentali su banco è stata verficata la funzionalità del codice di controllo e la tenuta idraulica della camera. L’analisi fotogrammetrica delle deformazioni conferma la tendenza dei risultati relativi al modello FSI, per cui al crescere della pressione (prova statica) o della portata (prova dinamica) corrisponde l’aumento delle deformazioni.I valori di deformazione derivanti dai due modelli risultano confrontabili, sebbene ci siano delle differenze di stima dovute agli errori di misura che derivano da un set-up sperimentale non ottimale e dalle approssimazioni introdotte per l’analisi delle deformazioni; in ogni caso tali differenze sono colmabili con degli opportuni fattori di correzione.Conclusione e sviluppi futuri Il modello analitico, nonostante alcuni limiti, è stato un valido strumento per introdurre le successive stime computazionali che permettono una predizione più precisa delle condizioni di stimolazione all’interno del bioreattore, in accordo con i risultati sperimentali, nonostante l’analisi fotogrammetrica risenta degli errori di misura dati dovuti al set-up di prova non ottimale. Questi errori potranno essere minimizzati conducendo ulteriori test sperimentali con micro-estensimetri che permettono di misurare più accuratamente la deformazione.Per una caratterizzazione più completa è possibile condurre test di sterilità, citotossicità/citocompatibilità oltre che di live imaging del condizionamento di diversi fenotipi cellulari. In generale si può affermare che la modellazione predittiva, che precede la realizzazione di questo bioreattore pulsatile, costituisce un’approccio innovativo nel campo TE perchè permette di ottimizzare la fase progettuale con un risparmio di risorse ed una previsione più accurata degli stimoli rispetto all’ approccio trial and error.