Studio dell'interazione tra nanoparticelle polimeriche e cellule tramite microfluorimetria risolta in tempo

Time resolved microfluorimetry techniques have important applications in biological and medical research because they allow to study, in a non invasive way through fluorescence emission, biophysical and biochemical processes taking place in sub-cellular structures, at micrometrical dimensions, and happening on time scales of the order of nanoseconds. Some informations regarding the status of a fluorophore are in fact contained in a fluorescence signal and can be found in its spectral properties and time dependent decaying. In this work I contributed to the development and characterization on a confocal configuration of the microfluorimeter, which permits working with better spatial resolutions. In particular this instrument was then used for the study of two different polymeric nanoparticles, with different potential applications in biomedicine: polyplexes, containing genetic material, interesting for gene delivery, and P3HT nanoparticles studied for inducing photo-physical properties in living cells. Time resolved fluorescence spectroscopy measurements were conducted on the latters, using a microscope coupled with a spectrometer and a streak camera. In vitro experiments showed that P3HT nanoparticles maintain their photo physical properties also once they have been internalized by HEK-293 cells, although with slight modifications with respect to the extracellular ones.

Le tecniche di microfluorimetria risolta in tempo sono importanti nella ricerca biologica e medica in quanto consentono di studiare, in maniera non invasiva attraverso l’emissione di fluorescenza, processi biofisici e biochimici che riguardano strutture sub-cellulari, di dimensioni micrometriche, e che avvengono su scale temporali dell’ordine dei nanosecondi. Alcune delle informazioni riguardo lo stato di un fluoroforo sono infatti contenute nella luce di fluorescenza e possono essere ricondotte alle sue caratteristiche spettrali e al suo tipo di decadimento temporale. In questo lavoro ho contribuito allo sviluppo e alla caratterizzazione di una configurazione confocale del microfluorimetro, che permette di ottenere migliori risoluzioni spaziali. In particolare questo strumento è poi stato utilizzato per lo studio di due diverse nanoparticelle polimeriche con potenziali applicazioni in campo biomedico: i poliplessi, contenenti materiale genetico e utilizzate per la gene delivery, e delle nanoparticelle di P3HT, utilizzate per indurre proprietà fotofisiche nelle cellule. Sulle seconde sono state effettuate misure di spettroscopia di fluorescenza risolta in tempo, utilizzando un microscopio accoppiato a uno spettrometro e a una streak camera.. E’ stato dimostrato, mediante esperimenti in vitro, che le nanoparticelle di P3HT, una volta internalizzate dalle cellule HEK-293, mantengono le loro proprietà fotofisiche con lievi variazioni rispetto al caso extracellulare.