Sviluppo e validazione di un sistema microfluidico per la generazione e coltura di tessuto cartilagineo umano

Microfluidics has become such a powerful tool that its application has been extended from analyzing simple systems such as proteins and DNA to more complicated biological systems such as living cells. This concept of cells on chips is appealing from a cell mechanics point of view, because microfluidic systems can be built that mimic the in vivo environment of cells, allowing mechanical behavior of cells to be studied under almost physiological conditions, with minimal consumption of reagents. This work was aimed to the development and creation of cellular pellet obtained with microfluidic technology .In order to obtain the device experimental characterization , we used human chondrocytes taken from the articolar cartilage taken from patients who had injuries or illness that have led to the damage of the tissue. The cell cultures experimental evidence were made at the research laboratory of the Galeazzi orthopedic clinic in Milan. The device used in this thesis is realized in polidimetilsilossano (PDMS), an elastomeric polymer silicone-based wich has properties that make it an excellent material for the microfluidic devices realization, using the soft-lithographic technic.The chips are assembled by gluing of two layers, each of them containing a fluidic path. Each layer is obtained by replica molding, which is a PDMS solution casting and the upcoming polymerization . The obtained chips were connected to a circuit in order to keep the cell pellet in perfusion.The circuit was realized by connecting the chip to a 50ml Falcon tube, containing fresh culture (reservoir), and to a 75cm2 T-Flask (waste) , in order to collect the medium came into contact with cells.After the expansion in monolayer the cells are seeded into the chip using a syringe pump obtaining the depositation of the cells in the chambers and the pellet training without the need of making a spin step instead necessary in order to obtain cell pellet with the traditional static culture. As compared were therefore considered both the pellet obtained from traditional static culture and without spin step. During the training and the development of the three-dimensional tissue ,in both static and perfused conditions, the cells must be able to produce the characteristic matrix of the native tissue in order to develop a construct with mechanical and biochemical features similar to the healthy source one. In addition to the chemical factors, the mechanical stimulation plays a key role in the maintaining of the cell phenotype. The shear stress ,induced by the hydrodinamic flow throughthe culture medium within, seems to be the most important mechanical stimulus that can activate the mechano-trasduction of the signal. The extracellular matrix,transferring these effort on the cell membrane, allow to the cytoskeleton to translate them to the nucleus, where they trigger the expression or inhibition of particular genes. It may result in a change in cell phenotype and than stimulate the production of specific proteins in the tissue.Perfusion also allow an adequate supply of oxygen even the innermost layer of the cell pellet; in the inner part of this structure under static conditions the oxygen concentration is in fact too low for proper development of cells in culture [51] Once the circuit is characterized and tested experimentally through test cell, the obtained pellets, both in static and perfusion culture, were characterized by biochemical and histological analysis.  

La manipolazione di fluidi su scala micrometrica, disciplina che prende il nome di microfluidica, ha avuto un grande sviluppo nel corso della scorsa decade. Il motivo principale è legato a un concomitante sviluppo dei processi realizzativi e del grado di complessità dei dispositivi microfluidici. I dispositivi microfluidici portano notevoli vantaggi legati ai piccoli volumi in gioco; ad esempio nel campo delle analisi biochimiche, garantiscono un’elevata efficienza pur richiedendo modiche quantità di campioni e reagenti. In aggiunta la microfluidica si sta pian piano rivelando uno strumento fondamentale per l’analisi non solo di composti relativamente semplici, quali proteine e DNA, ma anche di sistemi biologicamente più complessi, quali cellule e tessuti. Il concetto di cells on chips è interessante soprattutto dal punto di vista della meccanica cellulare, in quanto i dispositivi microfluidici di per sé offrono la possibilità di garantire un ambiente tridimensionale controllato simile a quello presente in vivo. In questo modo viene data la possibilità di studiare il comportamento delle cellule sotto condizioni pressoché fisiologiche, con il minino spreco in termini di numero di cellule richieste e di costosi reagenti. Il presente lavoro è stato volto alla generazione e alla coltura di microtessuto cartilagineo (pellet di condrociti primari) all’interno dispositivi microfluidici. Al contrario di quanto avviene in studi biologici tradizionali, i pellet sono stati realizzati senza il processo di centrifugazione, che risulta di non pratica realizzabilità alla microscala. Il dispositivo utilizzato in questo lavoro di tesi è stato realizzato tramite tecnica soft-litografica in polidimetilsilossano (PDMS), un polimero elastomerico a base siliconica che presenta proprietà che lo rendono un ottimo materiale per la realizzazione di dispositivi microfluidici in applicazioni biologiche. I chip sono stati assemblati mediante incollaggio di due strati, ognuno dei quali contenente un percorso fluidico. Ogni strato è stato ottenuto mediante replica molding, ovvero per colata di una soluzione di PDMS e la successiva polimerizzazione. In particolare lo strato inferiore è stato progettato in modo da alloggiare una camera per la coltura, dotata di uno scalino atto a favorire la deposizione delle cellule all’interno della camera stessa; lo strato superiore invece ospita un canale per la movimentazione del mezzo, dotato di due zone dedicate all’intrappolamento di eventuali bolle d’aria. Per la validazione biologica dei dispositivi sono stati utilizzati condrociti umani prelevati da cartilagine articolare asportata da pazienti che presentavano traumi o patologie che hanno portato al danneggiamento del tessuto. Le prove sperimentali di colture cellulari sono state svolte presso il Laboratorio di Ricerca dell’Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano. I chip ottenuti sono stati poi collegati a un circuito di perfusione sviluppato ad hoc, in grado di garantire la corretta semina delle cellule e il cambio del mezzo di coltura ad intervalli temporali regolari. Il circuito è stato realizzato collegando il chip a un tubo Falcon da 50 ml, contenente mezzo di coltura (reservoir), e ad una T-Flask da 25 cm2 (waste), per la raccolta del mezzo di coltura entrato in contatto con le cellule. Per quanto riguarda le prove di validazione cellulare, dopo l’espansione in monostrato, le cellule sono state seminate nel chip tramite pompa a siringa, ottenendo la deposizione delle cellule nella camera. Come termine di confronto sono stati realizzati pellet cellulari in tubi Eppendorf, ottenuti sia mediante centrifugazione sia tramite pura sedimentazione gravitazionale. Il dispositivo si è rivelato funzionale per quanto riguarda la semina cellulare e la generazione di pellet. Infatti le cellule si sono depositate sul fondo della camera con adeguata efficienza, e formano un tessuto sferoidale entro le prime 24 ore. Le colture cellulari sono state protratte in condizioni di perfusione dinamica per 14 giorni, ovvero un tempo adeguato affinché le cellule esprimano il corretto fenotipo ed esprimano un’adeguata matrice cellulare. La caratterizzazione biologica dei pellet cellulari è stata effettuata sia dal punto di vista biochimico che istologico. In particolare per ottenere informazioni riguardanti la capacità dei condrociti di esprimere il loro fenotipo è stata valutata la concentrazione di glicosaminoglicanisolfato (sGAG) e di DNA nei pellet. In particolare è stato calcolato il rapporto sGAG/DNA per avere un’indicazione relativa alla produzione di matrice da parte dei condrociti. Nel singolo campione potrebbero però essere presenti molte cellule metabolicamente attive e poco produttive o un numero limitato di cellule attive ma capaci di produrre molta matrice extracellulare. Per questo motivo sono stati affiancati a questi dati anche quelli relativi al rapporto Alamar/DNA, indicativi della vitalità cellulare. I risultati mostrano un’attività metabolica dei pellet microfluidici comparabile con quella con quella dei pellet di controllo, a dimostrazione della possibilità di ottenimento di pellet tramite chip microfluidici. Inoltre i risultati ottenuti dal saggio di quantificazione di sGAG, effettuati per avere una stima della produzione della matrice extracellulare da parte dei condrociti, mostrano valori significativamente maggiori per i pellet microfluidici. Durante la formazione e lo sviluppo del tessuto tridimensionale, sia in condizioni statiche che perfuse, le cellule devono essere in grado di produrre la matrice caratteristica del tessuto nativo, al fine di sviluppare un costrutto con caratteristiche meccaniche e biochimiche simili a quello sano di origine. Oltre ai fattori chimici, la stimolazione meccanica gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento del fenotipo cellulare. Inoltre la perfusione permette un adeguato apporto di ossigeno anche agli strati più interni del pellet cellulare; nella parte più interna di queste strutture in condizioni statiche la concentrazione di ossigeno risulta infatti troppo bassa per uno sviluppo adeguato delle cellule in coltura. In conclusione il dispositivo realizzato permette la sedimentazione di cellule all’interno della camera di coltura e il successivo sviluppo fino alla formazione di un pellet. Nonostante nelle prove sperimentali per la caratterizzazione biologica siano stati utilizzati condrociti di cartilagine articolare, questo dispositivo è adatto alla formazione di pellet anche a partire da altre popolazioni cellulari. In ultimo nel futuro sviluppo di questo dispositivo si prevede di ottenere molteplici pellet a partire da una singola piattaforma.