Spettroscopia ultraveloce di carotenoidi in soluzione e in complessi antenna

Carotenoids are pigments present in all photosynthetic organisms. They perform essential roles in photoprotection and light harvesting so that they are among the most investigated organic molecules. In detail, they protect the photosynthetic apparatus by dissipating the excess solar energy and by quenching both triplet excited chlorophyll (Chl) and singlet oxygen due to their low-lying triplet state. This is their essential role and there would be no photosynthesis in the presence of oxygen without them. In addition, they serve as accessory light-harvesting pigments: light absorbed by donor carotenoids in the blue, green and yellow regions of the spectrum is transferred to acceptor chlorophylls via singlet-singlet energy transfer, thereby making it available to drive photosynthesis. In purple bacteria carotenoids develop their functions inside light-harvesting antenna-complexes that can be distinguished in peripheral and core antenna-complexes, called respectively LH2 and LH1. These complexes also contain bacteriochlorophylls (BChls), pigments responsible of harvesting the sun light and transferring the energy to a reaction center (RC) that drives the chemical reaction of the photosynthesis. The LH2 complexes have a circular structure consisting of nine identical subunits, each one accommodating three BChls molecules and one carotenoid. The carotenoid spans the membrane and comes in close contact with two BChls molecules absorbing light at 850 nm (B850) and one BChl molecule absorbing at 800 nm (B800). As we mentioned before, carotenoids assist BChls by absorbing sun light in the visible spectral region and increasing the light-harvesting process efficiency. In order to unravel the molecular factors controlling light-harvesting and to estimate the carotenoids-to-BChl energy transfer efficiency, it is important to understand the excited state dynamics of carotenoids. The goal of this thesis is to investigate energy relaxation dynamics in carotenoids both in solution and inside the LH2 complex of purple photosynthetic bacteria. These studies are performed on spheroidene, a specific carotenoid extracted from membranes of anaerobically grown Rhodobacter sphaeroides wild type 2.4.1. with conjugation length (number of π-electron conjugated carbon-carbon double bonds) n=10. To study in real time the energy transfer processes we use a technique that allows one to observe in real time the evolution of an optically excited sample: the pump-probe technique. A first energetic pump pulse, resonant with an electronic or vibrational transition of the system under study, perturbs the absorption, then the system evolution following excitation is monitored by measuring the differential transmission change (∆T/T) of a delayed, weak probe pulse. The temporal resolution of the experiment is determined by the duration of the pulses so that we need very short pulses in order to observe in real time very fast processes. In addition, to probe transition occurring at different frequencies, tunability of both pump and probe pulses is required. In our laboratory we can generate ultrashort pulses that can reach sub-10 fs duration, tunable throughout the visible and the near infrared, allowing us to probe the early events of energy relaxation in carotenoids with unprecedented temporal resolution. To obtain ultrashort pulses our system starts with a mode-locked Ti:sapphire laser with chirped pulse amplification, producing 500-µJ, 150 fs pulses at 790 nm, and 1 kHz repetition rate. These pulses are used to pump two non collinear optical parametric amplifiers (NOPAs), which have the capability of generating broadband pulses. The first NOPA produces 10-15 fs pulses with tunable center frequency around 900 nm exploiting a couple of prisms for the compression stadium; the second NOPA generates ultrabroadband visible pulses with bandwidth spanning the 500-700 nm wavelength range and sub-10-fs duration. The visible pulses are compressed by multiple reflections onto chirped dielectric mirrors. The pulses derived from the NOPAs are synchronized by a delay line and focused on the sample using only reflective optics, in a non-collinear pump-probe configuration. To derive a complete picture of the light-triggered molecular evolution, it is crucial to detect the pump-probe signal over the broadest possible range of probe wavelengths, thus obtaining a two-dimensional (2D) ∆T/T map as a function of wavelength and time delay between pump and probe pulses. To understand the carotenoid excited state relaxation pathways we performed pump-probe experiments on spheroidene in organic solvents and inside the LH2 complexes. In this way we can directly evaluate the energy transfer efficiency from the carotenoid to the bacteriochlorophylls. Carotenoids photophysics is governed by two lying exited singlet states, called S1 and S2. The first one is forbidden for symmetry reason, so that the photoexitation occurs from the ground state to the allowed S2 state. From our measurements we can say that after photoexcitation the S2 state undergoes rapid decay to S1 by an internal conversion processes occurring in few hundreds of femtoseconds. Thanks to our temporal resolution we were able to add an intermediate state in the electronic level pictures that is not possible to detect with longer pulses. Measurements performed on spheroidene in solution have suggested that this additional excited singlet state lies between S1 and S2, and the initial relaxation from S2 occurs on a time scale less than 25 fs. Performing measurements in the LH2 complex, new channel of energy relaxation due to energy levels of the bacterioclhoropylls are opened so that the ultrafast dynamics of the carotenoid is modified. A comparison between the results for the carotenoid in solution and within the LH2 complex has allowed us to assess the efficiency of energy transfer from carotenoids to BChls, starting both from the S2 and the S1 states, and including the contribution of this new state. From our calculations we can conclude that the energy transfer process can reach efficiency higher than 90%, confirming the extremely high efficiency in light- harvesting process of photosynthetic organisms.

L’interesse verso lo studio dei primi eventi che innescano i processi fisici nei sistemi naturali ha portato, negli ultimi decenni, a sviluppare tecniche in grado di indagare processi biochimici su scale temporali estremamente veloci ed accessibili, allo stato attuale, solo grazie ad impulsi ottici ultrabrevi. Con l’utilizzo di impulsi laser ultraveloci è stato possibile inaugurare un interessante segmento scientifico di enorme attualità: la spettroscopia ultraveloce. Mediante questa tecnica è stato possibile osservare una serie di fenomeni fisici che si verificano su scale temporali brevissime. Tra questi, particolare attenzione meritano i processi di raccolta della luce e di trasferimento energetico nelle unità fotosintetiche. Le principali molecole coinvolte in questi processi sono i carotenoidi e le clorofille. I carotenoidi sono pigmenti essenziali per la sopravvivenza degli organismi fotosintetici. Si comportano come sistemi di difesa contro gli effetti tossici dell’ossigeno di singoletto e degli stati di tripletto delle clorofille. Oltre a svolgere il ruolo di fotoprotezione degli apparati fotosintetici, i carotenoidi sono pigmenti ausiliari nel processo di raccolta della luce (light harvesting LH), coprendo la regione spettrale visibile del blu-verde dove le clorofille non presentano un forte assorbimento. La luce assorbita dai carotenoidi passa, mediante meccanismi di trasferimento energetico, alle clorofille che innescano la catena di reazioni della fotosintesi. I carotenoidi svolgono la maggior parte delle loro funzioni biologiche all’interno di specifiche proteine; in particolare, le proprietà degli stati eccitati di queste molecole sono state studiate principalmente in complessi antenna di raccolta della luce ( light harvesting LH) e sono state comprese al meglio nelle unità fotosintetiche dei batteri rossi. Questi complessi contengono le batterioclorofille, pigmenti responsabili della raccolta della luce solare il cui ruolo è quello di trasferire l’energia ad un centro di reazione (reaction center RC) dove avviene la reazione fotochimica della fotosintesi. I complessi antenna LH2 posseggono una struttura cilindrica che consiste di nove sub-unità identiche, ognuna contenente tre batterioclorofille e un carotenoide. Il carotenoide si estende attraverso la membrana fotosintetica ed è a contatto da un lato con due batterioclorofille che assorbono a 850 nm (chiamate B850) e dall’altro con una batterioclorofilla che assorbe a 800 nm (B800). I carotenoidi assorbono la parte di radiazione solare visibile, lontana dai picchi di assorbimento delle batterioclorifille, aumentando così l’efficienza del processo di raccolta della luce delle unità foto sintetiche. Per comprendere i fattori che guidano i meccanismi di raccolta della luce e l’efficienza del trasferimento energetico è importante dunque conoscere le proprietà fotofisiche dei carotenoidi. L’obiettivo di questa tesi è lo studio delle dinamiche di rilassamento energetico di carotenoidi in soluzione e all’interno del complesso antenna LH2 dei batteri rossi fotosintetici. I nostri studi verranno realizzati sullo sferoidene, uno specifico carotenoide estratto dal batterio rosso Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 che possiede una lunghezza di coniugazione (ovvero il numero di doppi legami carbonio-carbonio di elettroni coniugati π) pari a 10. Per il nostro studio utilizzeremo la spettroscopia ottica ultraveloce che rappresenta uno strumento d’indagine unico per la comprensione delle dinamiche di processi ultrarapidi. L'esperimento fondamentale della spettroscopia risolta in tempo è il cosiddetto pump-probe. Questa tecnica prevede che un primo impulso di luce ultrabreve, chiamato impulso di “pump”, inneschi un processo fotoindotto; la successiva evoluzione del sistema viene studiata misurando la variazione di trasmissione (trasmissione differenziale ΔT/T) di un debole impulso di “probe” opportunamente ritardato. La risoluzione temporale dell'esperimento è determinata dalla durata degli impulsi di pump e di probe, così che sono necessari impulsi molto brevi per osservare processi veloci. Inoltre, la necessità di eccitare un sistema in risonanza e sondare transizioni ottiche a differenti frequenze richiede accordabilità sia dell'impulso di pump sia di quello di probe. La generazione di impulsi di luce accordabili e della durata di pochi cicli ottici è un traguardo difficile da raggiungere. Le sorgenti convenzionali di impulsi ultrabrevi infatti producono impulsi relativamente lunghi (circa 100 fs) e ad una lunghezza d'onda fissa. Nel nostro laboratorio siamo in grado di generare impulsi di luce con durata che si avvicina al valore minimo stabilito dal periodo di oscillazione della luce (da 2 fs nel visibile a 5 fs nel vicino infrarosso), allargando il loro intervallo di accordabilità mediante effetti ottici non lineari. La sorgente utilizzata nei nostri esperimenti è costituita da un laser in Ti:zaffiro in mode-locking amplificato mediante un sistema chirped pulse amplification (CPA), che produce impulsi da 150 fs a 790 nm, con energia di 500 μJ ad una frequenza di ripetizione di 1kHz. Questi impulsi sono inviati in due amplificatori ottici parametrici (OPA) in configurazione non collineare (non-collinear OPA, NOPA), che rappresentano gli strumenti più efficaci per la generazione di impulsi brevi accordabili. In un OPA un debole impulso di “seme” a larga banda viene amplificato di molti ordini di grandezza in un cristallo non-lineare del secondo ordine. Tali impulsi a larga banda possono successivamente essere compressi alla durata minima consentita dalla loro banda tramite opportune linee di ritardo dispersive. Il primo NOPA produce impulsi a larga banda da 10-15 fs con frequenza centrata attorno 900 nm; il secondo genera impulsi nel visibile, con banda compresa tra 500 e 700 nm e una durata di meno di 10 fs. Per i nostri scopi abbiamo realizzato gli esperimenti di pump-probe sullo sferoidene in solventi organici e nel complesso antenna LH2, in modo da comprendere le dinamiche degli stati eccitati dei carotenoidi in entrambi i casi. In questo modo siamo in grado di valutare direttamente l’efficienza del trasferimento energetico dal carotenoide alle batterioclorofille mediante un’analisi comparata. La fotofisica dei carotenoidi è governata da due stati eccitati di singoletto chiamati S1 e S2. Poiché lo stato S1 è proibito per ragioni di simmetria, l’eccitazione avviene dallo stato fondamentale verso lo stato S2. Dalle misure realizzare sullo sferoidene abbiamo concluso che in seguito alla fotoeccitazione, la popolazione passa dallo stato S2 allo stato S1 attraverso un processo di conversione interna che avviene in alcune centinaia di femtosecondi. Grazie all’elevata risoluzione temporale disponibile è stato possibile aggiungere uno stato intermedio alla descrizione dei livelli elettronici eccitati del carotenoide, che non si è in grado di vedere con impulsi più lunghi. Le misure di pump-probe sullo sferoidene in soluzione hanno suggerito che il decadimento interno da S2 verso questo stato intermedio , situato tra S2 e S1, avviene in meno di 25 fs. Per quanto riguarda invece le misure sul complesso LH2, le dinamiche interne dei rilassamenti dell’energia del carotenoide si modificano a causa della presenza dei livelli energetici delle batterioclorofille che aprono nuovi canali di diseccitazione. Dal confronto tra i risultati ottenuti sulle dinamiche dello sferoidene in soluzione e nel complesso LH2 siamo stati in grado di stimare l’efficienza del processo di trasferimento energetico dagli stati S1 e S2 dal carotenoide alle batterioclorofille, considerando anche il nuovo stato intermedio. Dalle nostre analisi abbiamo concluso che l’efficienza del processo di trasferimento energetico supera il 90%, confermando l’elevata efficienza del processo di raccolta della luce negli organismi fotosintetici.