Characterization of breast tissue using diffuse optical spectroscopic imaging, for non-invasive monitoring of breast lesions

Diffuse Optical Spectroscopy (DOS) is a Frequency Domain technique, able to measure tissue functional changes in parameters such as water, lipid, oxygen saturation, oxy-, deoxy-, and total-hemoglobin. Tissue optical properties are probed using a near-infrared light that is sinusoidally modulated in intensity at high frequencies. Differences in terms of phase shift and amplitude decay between the signal coming out from the tissue and the light initially injected in it, allow to evaluate absorption and scattering spectra of the sample. The main aim of this work has been the characterization of healthy and diseased breast tissue using Diffuse Optical Spectroscopic Imaging (DOSI), to monitor breast lesions and potentially predict the response to Neoadjuvant chemotherapy (NAC). Tumor tissue usually shows increased water and oxy-hemoglobin content, and decreased lipid content with respect to the surrounding normal tissue. For this reason, the stratification of the population according to patients’ characteristics and tumor characteristics led to statistically significant results in terms of DOSI parameters values. In particular, water, lipid, and oxy-hemoglobin contents showed a strong correlation with breast density. Tumor depth is inversely correlated with tumor maximum size, and their combination can be used to predict tumor lipid content, oxygen saturation, and Tissue Optical Index, defined as a combination of water, lipid, and deoxy-hemoglobin concentrations. As regards tumor response to NAC, low histological grade tumors tend not to respond, while more aggressive and differentiated tumors are more likely to have a complete cancer remission. Low oxygen saturation contrast between tumor and healthy tissue is another predictor of high chance of total tumor remission. When the dataset is stratified according to the molecular subtype of the tumor, Luminal A can be distinguished from Triple Negative by looking at combinations of DOSI parameters. Triple Negative tumors have lower levels of deoxy-hemoglobin, and thus higher metabolism, and show a higher percentage of complete response to NAC. Absorption and scattering spectra allow to separate malignant tumors from pre-malignant and benign ones, and from the mean values in contralateral healthy breast. Indeed, the scattering slope becomes steeper and the absorption gets higher as the tumor malignancy increases. The addition of collagen spectrum to the fit leads to good tumor to normal contrast. A strong linear correlation can be found between collagen content and scattering power.

In anni recenti, l’imaging ottico si è rivelato utile nell’affiancare le tecniche diagnostiche tradizionali, per la capacità di investigare le variazioni funzionali all’interno del tessuto. Nelle tecniche che operano nel dominio delle frequenze, un fascio di luce nel vicino infrarosso viene sinusoidalmente modulato ad alte frequenze e iniettato all’interno del tessuto, al fine di sondarne le proprietà ottiche. L’idea su cui si basa la Spettroscopia Ottica Diffusiva (DOS) utilizzata in questo lavoro, è che la luce raccolta in uscita è sfasata e demodulata rispetto al fascio iniziale di illuminazione, poiché gli assorbitori e le particelle diffusive presenti nel campione rimuovono o deviano i fotoni del fascio. A partire dalla variazione in fase e ampiezza dell’onda, è possibile ricavare lo spettro di assorbimento e di scattering, e la concentrazione dei principali cromofori del tessuto. Per fare ciò, si parte dal presupposto che il tessuto sia composto principalmente da quattro cromofori (acqua, lipidi, emoglobina ossigenata e emoglobina deossigenata). I loro spettri base di assorbimento vengono combinati linearmente e usati per fare un fit delle curve sperimentali, da cui ricavare le concentrazioni dei singoli costituenti. Il lavoro presentato nel manoscritto ha avuto come scopo principale la caratterizzazione non invasiva del tessuto mammario e dei tumori al seno. È stato precedentemente dimostrato che la DOS permette di distinguere il tessuto sano da quello tumorale, e risulta efficace nel monitorare l’evoluzione del tumore e la sua risposta ad una data terapia. Lo studio è stato condotto su 128 soggetti, partecipanti a diversi studi clinici. Per la maggior parte di essi (107) è stata misurata non solo una griglia di punti sul seno contenente tessuto tumorale, ma anche una griglia speculare sul seno sano. I dati di ciascun soggetto sono stati processati mediante codici Matlab. Un team esterno di statistici è stato usato come supporto per la parte multiparameterica dell’analisi. Le osservazioni più interessanti possono essere fatte stratificando la popolazione sulla base di caratteristiche proprie del tumore o del soggetto. In particolare, la composizione del seno è largamente condizionata da fattori quali l’età, lo stato menopausale e la densità del seno. Per questo motivo, esiste una forte correlazione tra tali categorie e i valori dei cosiddetti parametri DOSI (Diffuse Optical Spectroscopic Imaging). Oltre ai quattro cromofori principali, tali parametri includono l’emoglobina totale, la saturazione di ossigeno, la pendenza e l’ampiezza della curva di scattering, e il Tissue Optical Index (TOI), definito in modo tale da evidenziare al meglio il contrasto tra tessuto malato e sano: la concentrazione di acqua e emoglobina deossigenata a numeratore tendono ad essere elevate all’interno del tumore, mentre il contenuto di lipidi a denominatore è più basso nel tumore rispetto al tessuto circostante. Per quanto riguarda gli spettri di assorbimento e di scattering, l’obiettivo è stato quello di separare i tumori benigni da quelli pre-maligni e maligni, e dalla media dei valori nel seno sano. La distinzione tra tessuto tumorale e tessuto normale nei tumori maligni è ben evidente in termine di scattering: la pendenza e l’ampiezza della curva sono tendenzialmente maggiori in corrispondenza della lesione. Gli spettri di assorbimento, invece, permettono di separare in modo significativo anche i tumori pre-maligni e benigni. Infatti, il tumore maligno assorbe più del tumore pre-maligno, che a sua volta ha un assorbimento superiore al tumore benigno. Il maggiore contrasto si ha in corrispondenza del picco dell’acqua a 980 nm. Quando si cerca di separare i soggetti anagraficamente più anziani da quelli più giovani, si osserva lo stesso picco nel contrasto tra gli spettri di assorbimento. Tumori maligni, pre-maligni e benigni possono essere distinti anche sulla base del contenuto di emoglobina ossigenata, deossigenata e totale. Il contenuto di acqua, lipidi ed emoglobina ossigenata risulta invece correlato alla densità del seno, con p-values molto piccoli del test di Kruskal-Wallis. Dal punto di vista della classificazione istologica dei tumori, il carcinoma lobulare invasivo (ILC) presenta una pendenza della curva di scattering molto inferiore rispetto al carcinoma duttale invasivo (IDC). Ciò significa che quest’ultimo è caratterizzato da particelle diffusive più piccole. La profondità e la dimensione massima del tumore risultano essere inversamente correlate tra loro. La combinazione di entrambi i fattori, inoltre, è un forte predittore del contenuto lipidico all’interno del tumore, e del valore del TOI e della saturazione di ossigeno. Per quanto riguarda la risposta alla chemioterapia neoadiuvante (NAC), somministrata prima dell’eventuale operazione chirurgica, possono essere fatte alcune osservazioni. Per prima cosa, i tumori aventi grado istologico basso tendono a non rispondere alla NAC. Al contrario, quasi la metà dei tumori aggressivi e maggiormente differenziati, entrambi indicatori di un alto grado istologico, risponde alla terapia con la totale remissione del tumore. Inoltre, è possibile notare che i soggetti che presentano un basso contrasto tra la saturazione dell’ossigeno nel tumore e quella nel tessuto sano, hanno una maggiore responsività alla terapia. I tumori possono essere suddivisi in sottotipi molecolari, a seconda che esprimano o meno i recettori per gli estrogeni (ER), per i progesteroni (PR) e per il fattore di crescita epidermico umano (Her2). Oltre a ciò, esistono altri due proteine che fungono da marcatori tumorali: la p53 e la Ki67. È dunque possibile distinguere quattro categorie principali (Luminal A, Luminal B, Triple Negative e Her2), più altre due in cui ricadono i soggetti privi di alcune informazioni necessarie alla classificazione (HR Positive e HR Negative). Poiché i tumori Luminal A e quelli Triple Negative mostrano le più grandi differenze dal punto di vista genetico, uno degli obiettivi dell’analisi è stato cercare di separare queste due categorie estreme, valutandone i parametri DOSI. La combinazione dei valori di emoglobina ossigenata e deossigenata nel tumore porta a catalogare i Triple Negative come tumori ad alto metabolismo, poiché i valori di emoglobina deossigenata tendono ad essere più bassi di quelli nei tumori Luminal A. Esaminando invece la combinazione di emoglobina totale e saturazione dell’ossigeno, si può notare come i tumori Luminal A siano caratterizzati da valori bassi per entrambi i parametri, al contrario dei Triple Negative. Dal punto di vista della responsività alla NAC, nessuno dei pazienti Luminal A ha risposto completamente alla terapia. Al contrario, tra i tumori Triple Negative il tasso di risposta è stato di 12 soggetti su 17. L’ultima sezione di questo lavoro introduce un nuovo cromoforo all’analisi spettroscopica: il collagene. Pur essendo uno dei componenti principali del tessuto fibroghiandolare, infatti, il collagene non era finora stato inserito tra i principali cromofori usati per il fit delle curve sperimentali al Beckman Laser Institute. L’interesse nei confronti del collagene nasce dal fatto che la densità del seno è notoriamente uno dei fattori di rischio per l’insorgenza del tumore, e i seni mammograficamente densi sono caratterizzati da un’elevata quantità di tessuto fibroghiandolare. Ciò, potenzialmente, implica un’associazione indiretta tra il contenuto di collagene nel seno ed uno dei fattori rischio. Per approfondire questo legame e valutare l’impatto del collagene sul contrasto tumorale, 18 soggetti sono stati rianalizzati introducendo lo spettro del collagene accanto a quello dell’acqua, dei lipidi e delle due emoglobine. Tale spettro, misurato dal gruppo del Dipartimento di Fisica del Politecnico di Milano, presenta due picchi principali nel vicino infrarosso, a 910 nm e 1030 nm. La vicinanza tra tali picchi e picchi di assorbimento dei lipidi (930 nm) e dell’acqua (980 nm) implica che parte della componente spettrale precedentemente attribuita a questi due componenti venga ora riconosciuta come contenuto in collagene. L’introduzione del collagene non è utile solo alle basse frequenze, ma permette di descrivere al meglio anche la coda spettrale al di sotto degli 800 nm, poiché ridimensiona il contributo dell’emoglobina ossigenata. Per caratterizzare il contrasto tra tumore e tessuto sano è stato utilizzato l’indice OI, che include a numeratore la concentrazione di acqua e collagene, nonché la pendenza della curva di scattering, e a denominatore la concentrazione di lipidi. I pazienti riprocessati presentano un OI di 4.5 ± 2.5 nel tumore e di 1.1 ±0.4 nel tessuto sano. Per la scarsa significatività statistica del campione rianalizzato, non è stato possibile dimostrare una chiara associazione tra contenuto di collagene e densità del seno. Il parametro DOSI che presenta l’associazione più significativa con il collagene è la pendenza della curva di scattering: è possibile individuare una correlazione lineare tra tali parametri, con R2=0.69 in corrispondenza della lesione e R2=0.82 nel seno controlaterale.