Computational design of a novel enzyme for the prevention of Advanced Glycation End-products protein crosslinks

Introduction: The progressive accumulation of Advanced Glycation End-products (AGEs) in the human body leads to several deleterious consequences, which include tissue stiffening and pathologies such as arteriosclerosis, nephropathy, retinopathy and Alzheimer’s disease. Nowadays, there are no effective therapies against AGEs build-up. A promising strategy is believed to consist in the development of pharmacological tools based on the use of specific deglycating enzymes (FAOXs) that are known to catalyze the de-glycosylation of fructosyl amino acids. However, in their wild type form these enzymes are completely inactive towards entire proteins owing to the hindered accessibility to their buried active site. In addition to their use as therapeutic tools for protein deglycation, enzymatic assays based on FAOXs can potentially serve as rapid and economical diagnostic tools to measure glycated hemoglobin (HbA1c), which is a validated marker for the insurgence and the development of diabetes mellitus. Finally, a possible further application of engineered FAOXs is related to food preservation as exogenous AGEs precursors (the so-called Amadori products) are readily formed in heat-processed food. The negative effects of dietary AGEs on human health are related to their ability to induce cellular oxidative stress and tissue inflammation. Moreover, AGEs formation is detrimental to the nutritional quality of dairy products. Therefore, the development of efficient strategies for preventing the formation of glycation products in heat-processed food is warranted. In this context, FAOX enzymes represent a potential tool for limiting Amadori product formation in dairy and meat products. To date, an engineering approach to rendering naturally occurring FAOXs active toward entire proteins or allowing them to specifically recognize fructosyl-valine (the glycated N-terminal residue of HbA1c) has been hindered by the limited knowledge that is available on the molecular mechanisms that regulate substrate specificity in this class of enzymes as well as by the almost complete lack of information on their tridimensional structures. Aim: The goal of the work that I did for my thesis is to develop a rational in-silico design strategy for engineering novel FAOX mutants with a wider active site to allow for the deglycation of intact proteins. To this end, a comparison between different FAOX family members is necessary in order to shed light on the molecular bases of their substrate specificity. Phase I: Crystal structure and modeling of wild-type Amadoriase I. We obtained the high resolution complete crystal structures of the free and the substrate-bound form of Amadoriase I using high-energy synchrotron radiation. Based on these data and using molecular dynamics simulations, we then provided a detailed description of the tunnel conformation that leads to the active site of the enzyme as well as the free energy profile experienced by the ligand in going from bulk water to the catalytic cavity. We demonstrated the presence of four gating helices/loops, followed by an “L-shaped” narrow cavity. In summary, we believe that the tridimensional architecture of Amadoriase I that we determined provides a reference structural framework for the design of novel enzymes for protein deglycation. We also provided further enzyme characterization by a number of in vitro experiments, including thermal denaturation, determination of monomeric state, binding assay and rapid kinetic experiments in normal and anaerobic conditions. Phase II: Computational characterization of different FAOX enzymes We used molecular dynamics simulations and advanced modeling techniques to investigate the most relevant wild-type FAOX enzymes (Amadoriase I, Amadoriase II, PnFPOX, FPOX-E and N1-1-FAOD) in order to elucidate the molecular mechanisms that drive their specificity towards polar and nonpolar substrates. Specifically, we compared these five different FAOX in terms of overall folding, ligand entry tunnel, ligand binding residues and ligand binding energies. This part of work provides the foundation for the the next step, the rational design of an engineered FAOX enzyme. Phase III: Computational design and experimental production of an engineered FAOX enzyme with a potentially expanded substrate recognition spectrum. Using an iterative approach, we built a library of FAOX mutants based on Amadoriase I and similar wild type structures available in Protein Data Bank (PDB). In our engineering approach, we focused on the redesign of two regions that are not directly involved in the catalytic activity of the enzyme. The templates that we used as scaffold structures for our computational work have a similar, albeit in selected regions slightly more open, global fold when compared to Amadoriase I. We then modelled the primary sequence of these specific regions using the Rosetta software for protein engineering. Finally, library screening and mutant optimization was conducted using extensive molecular dynamics simulations in order to identify a mutant structure that showed (a) a stable and proper fold and (b) high affinity for f-lys. After selecting the most suitable candidate among our panel of designed enzyme mutants, we experimentally tested its expression and solubility using standard molecular biology and protein purification techniques. In particular, we have already optimized the expression conditions in bacteria and we are currently focusing on improving the solubility of the protein Conclusions: We provided the first complete high resolution crystal structure of a FAOX enzyme in its free and ligand-bound states. Using these information, we accurately characterized this enzyme in term of active site architecture, catalytic interactions, tunnel conformation, binding pathway and energies. Furthermore, using homology modelling techniques we compared the features of Amadoriase I with the other four most relevant members of the FAOX family. Finally, we computationally designed an engineered FAOX enzyme that may represent a step forward towards an efficient protein deglycation strategy. Furthermore, this work provides a general computational framework that can be exploited in the design of virtually any engineered proteins in a wide context of different applications.

Introduzione: L’invecchiamento ed alcuni stati patologici (come il diabete) conducono ad un progressivo accumulo di Advanced Glycation End-Products (AGEs) nel corpo umano. Questo produce numerosi effetti collaterali tra cui un generale irrigidimento dei tessuti ed è stato dimostrato avere un ruolo fondamentale in alcune patologie degenerative come l arterosclerosi, neuropatie, retinopatie, sindrome di Alzheimer o Parkinson. Ad oggi, non sono disponibili terapie efficaci contro l’accumulo di AGEs. Una strategia promettente consiste nello sviluppo di terapie farmacologiche basate sull’uso di una specifica classe di enzimi (FAOXs) capaci di deglicare i singoli amino acidi glicati. Questi enzimi, però, nella loro forma nativa, non hanno mostrato nessuna attivita’ su proteine glicate (quindi quando gli aminoacidi glicati inclusi in una catena polipeptidica) a causa nell’inacessibilita’ del loro sito attivo da parte di substrati di grandi dimensioni. Questa classe di enzimi risulta promettente, non solo per lo loro possibile applicazione terapeutica come agenti deglicanti di proteine, ma anche per il loro potenziale uso come sensore diagnostico, rapido ed economico, per misurare il livello di emoglobina glicata. Quest’ultima è stato dimostrato essere un valido marker a medio-lungo termine del stato di compensazione in pazienti affetti da diabete mellito. Infine, un’ulteriore possibile applicazione di questa classe di enzimi è relativa alla conservazione del cibo da alcuni precursori esogeni degli AGEs, che si formano tipicamente durante il processo di cottura dei cibi. Gli effetti negativi di questi AGEs introdotti con la dieta sulla salute umana sono relativi alla loro capacita di indurre uno stato di stress ossidativo a livello cellulare e, globalmente, un’infiammazione dei tessuti. Ad oggi, lo sviluppo di un metodo per ingegnerizzare questi enzimi rendendoli attivi verso substrati di dimensioni maggiori (quali intere proteine glicate) o per permettergli un riconoscimento esclusivo della fruttosil valina (il primo aminoacido all’ N-terminale dell’emoglobina glicata) è stato impedito dalla limitata conoscenza disponibile sui meccanismi molecolari che regolano la specificita’ di questa classe di enzimi e, piu in generale, dalla quasi completa mancanza di informazioni sulla loro struttura tridimesionale. Obiettivo del lavoro: L’obiettivo di questo lavoro di tesi è lo sviluppo in un metodo razionale computazionale per il design e l’ingegnerizzazione dell’Amadoriase I (un particolare esponente della classe degli enzimi FAOX). Questo processo di design prevede il design di mutanti ingegnerizzati aventi una maggiore accessibilita’ alla tasca catalitica attraverso un ingrandimento del suo tunnel di accesso, con l’obiettivo finale di produrre un nuovo enzima ingegnerizzato capace di deglicare intere proteine. Per questo fine, abbiamo suddiviso il lavoro in tre fasi: nella prima abbiamo determinato la struttura di Amadoriase I, utilizzato poi come dato di partenza per il processo di ingegnerizzazione. Abbiamo poi effettuato un confronto tra i diversi membri della famiglia dei FAOX enzimi per individuare il candidato migliore per il processo di ingegnerizzazione ed infine abbiamo sviluppato un metodo computazionale per il design e lo screening dei possibili mutanti ingegnerizzati di queste proteine. Fase I: struttura cristallografica e simulazioni di dinamica molecolare sulla forma nativa dell Amadoriase I Abbiamo ottenuto la prima struttura tridimensionali completa ad alta risoluzione dell’enzima di interesse nella sua forma libera e legata al suo substrato nativo (fruttosil-lisina) utilizzando la tecnica della cristallografia. Sulla base di questi dati, utilizzando diverse tecniche di dinamica molecolare, abbiamo quindi fornito una descrizione dettagliata della conformazione a “L” del tunnel che conduce al sito attivo dell'enzima così come del profilo di energia libera e delle posizioni sperimentate dal ligando nel passare dal solvente alla cavità catalitica. Abbiamo dimostrato la presenza di quattro loops agenti da “cancelli” che restringono l’accesso alla tasca catalitica dell’enzima per substrati di grandi dimensioni. In sintesi, riteniamo che l'architettura tridimensionale del Amadoriase I che abbiamo determinato fornisca un quadro strutturale di riferimento per la progettazione di nuovi enzimi per la deglicazione di proteine. Abbiamo inoltre fornito ulteriore caratterizzazione dell’enzima con una serie di esperimenti in vitro, tra cui denaturazione termica, la determinazione dello stato di monomero, e rapidi esperimenti cinetici in condizioni normali e anaerobiche. Fase II: caratterizzazione computazionale di diversi enzimi FAOX Abbiamo utilizzato simulazioni di dinamica molecolare e tecniche di modellazione avanzate per indagare i più importanti enzimi FAOX nativi (Amadoriase I, II Amadoriase, PnFPOX, FPOX-E e N1-1-FAOD), al fine di chiarire i meccanismi molecolari che guidano la loro specificità nei confronti substrati polari e non polari. In particolare, abbiamo confrontato questi cinque enzimi in termini di folding generale, tunnel di ingresso per il ligando, residui catalitici ed energie di legame. Questa parte del lavoro fornisce le basi per la fase successiva, la progettazione razionale di un enzima FAOX ingegnerizzato. Fase III: design computazionale e produzione sperimentale di un mutante ingegnerizzato dell’Amadoriase I progettato con uno spettro di riconoscimento del substrato potenzialmente espanso. Utilizzando un approccio iterativo, abbiamo costruito una libreria di mutanti FAOX modificando la struttura dell’Amadoriase I con strutture native disponibili nella Protein Data Bank (PDB). Nel nostro approccio ingegneristico, ci siamo concentrati sulla riprogettazione di due regioni che non sono direttamente coinvolti nella attività catalitica dell'enzima ma ne restringono l’accesso alla tasca. I modelli che abbiamo utilizzato come “scaffold” durante la fase di ingegnerizzazione hanno un folding simile a Amadoriase I nelle zone confinanti a quelle di interesse ma risultano piu’ aperte nelle regioni di accesso al tunnel catalitico. Abbiamo poi modellizzato la sequenza primaria di queste regioni specifiche utilizzando software gold-standard nell’ ingegnerizzazione proteica. Infine, lo screening delle librerie e l’ottimizzazione del mutante è stato condotto utilizzando estese simulazioni di dinamica molecolare volte all’identificazione di una struttura mutata che avesse (a) un folding globalmente stabile con particolare attenzione per le regioni modificate e (b) un’alta affinità per la fruttosil lisina. Dopo aver selezionato il candidato più adatto, abbiamo sperimentalmente testato la sua espressione e la sua solubilità utilizzando le tecniche standard di biologia molecolare e di purificazione di proteine. In particolare, abbiamo già ottimizzato le condizioni di espressione nei batteri e stiamo attualmente concentrandoci sul miglioramento della solubilità. Conclusioni: Abbiamo fornito la prima struttura di cristallografica alta risoluzione e completa di un enzima FAOX. Utilizzando queste informazioni, abbiamo accuratamente caratterizzato questo enzima in termini di architettura del sito attivo, interazioni catalitiche, conformazione del tunnel di accesso alla tasta catalitica, percorso di accesso alla tasca attiva e profilo di energia libera. Inoltre, sempre utilizzando tecniche di dinamica molecolare abbiamo confrontato le caratteristiche nostro enzima con gli altri quattro membri più importanti della famiglia di FAOX. Infine, abbiamo computazionalmente progettato un enzima FAOX ingegnerizzato che rappresenta un passo in avanti verso una strategia di deglicazione proteica efficace. Nel complessoe, questo lavoro fornisce un metodo computazionale generale che può essere virtualmente sfruttato anche nell’ingegnerizzazione di proteine differenti, in un ampio contesto di applicazioni diverse.