Vascular Tissue Engineering: coupled approach between a computational model and experimental strategies for in vitro pulsatile perfusion cultures on three-dimensional tubular scaffolds

The absence of successful solutions in treatments of small-caliber vessel (inner diameter <5mm) diseases has led to the Tissue Engineering application in vascular field in order to develop functional non-immunogenic tissue engineered blood vessels (TEBVs). For this, in vitro reproduction and maintenance of physiological biochemical microenvironment and biomechanical stimulations are one of the key factors. Also the scaffold architecture and structure play a pivotal role in obtaining successful outcomes in the field and in ensuring both the chemical-physics conditions, especially in presence of a layered structure similar to the natural blood vessels, and in presence of some proteins of extracellular matrix (ECM) and adhesive proteins to promote scaffold-cells interactions. In this context, the present research project focused on the development of new strategies and materials to improve the in vitro maturation of tubular scaffolds, permitting a better cell retention towards endothelial stability. We apply a coupled approach between the classical Tissue Engineering approach and a computational model for a priori estimation of physiological mechanical conditioning of the construct to be tissue-engineered. The adopted strategy allowes to: (1) enhance mass exchange through the three-dimensional (3D) scaffold to improve the biochemical microenvironment, (2) biomechanically stimulate the graft with a pulsatile perfusion predicted by a computational model, and (3) emulate the layered structure of blood vessels with a polymeric gel-coated scaffold. In this regard, the alternating exposure to culture medium and air, coupled with a convective flow induced by the longitudinal rotation permits efficiently to improve mass exchange through the thickness of the 3D porous tubular scaffold. The resulted optimization of mass transport determines advantages for 3D cell cultures in terms of cellular metabolism and colonization of the construct, thanks to nutrients and oxygen reaching also deeper structures of the scaffold. The efficiency of this phenomenon, demonstrated on a novel polyurethane foam, is ensured when pore size is at least 68 µm and in presence of a high ratio between pore and endothelial cell size. Concerning the mechanical stimulations, a scaffold-specific fluid-structure interaction (FSI) model is developed as a useful tool for the evaluation of circumferential deformations and wall shear stress acting on Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) and endothelial cells (ECs), respectively. According to these mechanical outcomes and starting from the mechanical properties of the scaffold, the model allows to a priori determine optimal physiological mechanical stimulation acting on the tubular scaffold seeded with ECs and VSMCs. This permits to suitably set and tune flow rates, especially in the case of viscoelastic scaffolds. To investigate cellular behavior in response to the FSI-defined mechanical stimulation pattern, pulsatile perfusion cultures are performed on decellularized human humbilical veins (dHUVs) seeded with ECs. Our findings well support the ability of the FSI model to estimate working pressures and circumferential deformations of the scaffold; on the contrary, cellular behavior under FSI-model-estimated wall shear stress is still on going. Regarding the issue to perfuse tubular porous scaffolds, a gel coating made of 8% w/v alginate and 6% w/v gelatin, functionalized with fibronectin, results suitable to prevent leakage through scaffold pores thanks to the crosslinking properties of alginate, occluding the pores. The cell-adhesive ability of gelatin, further improved by the presence of fibronectin functionalization, allowed to ECs to adhere and integrate within the gel, with advantages for cell proliferation. The superficial coating that covers just luminal pores without penetrating into the whole thickness of porous scaffolds permits to create a double-layered 3D structure, reproducing the organization of healthy blood vessels. The obtained scaffold is promising to keep anatomically separated the luminal surface from the media tunica but maintained functionally linked ECs with VSMCs. Thus, in the effort towards the development of not-immunogenic and functional TEBVs, this research project laid the basis to improve the in vitro development of small-caliber constructs in relation to: (1) the a priori optimization and control of biochemical environment and biomechanical conditioning, and (2) the production of tubular double-layered scaffolds with high potential to promote EC adhesion on the luminal side and VSMC colonization on the external surface, maintaining cells within two separated structures.

L’assenza di soluzioni cliniche soddisfacenti nel trattamento delle patologie che coinvolgono vasi di piccolo calibro (diametro<5mm) ha portato lo sviluppo dell’Ingegneria dei Tessuti in tale campo, con l’obiettivo di sviluppare vasi sanguigni ingegnerizzati (TEBVs) funzionali e non immunogenici. Pertanto, uno degli elementi fondamentali è la replicazione e il mantenimento in vitro del microambiente biochimico e delle stimolazioni biomeccaniche fisiologici. Inoltre, anche l’architettura dello scaffold, così come la presenza di una struttura simile al vaso sanguigno naturale e la presenza di proteine della matrice extracellulare (ECM) e proteine adesive che promuovono le interazioni scaffold-cellule rivestono un ruolo chiave per raggiungere risultati positivi in tale campo. In questo contesto, il presente progetto di ricerca si focalizza sullo sviluppo di nuove strategie e materiali per migliorare la maturazione in vitro di scaffold tubolari, per aumentare la ritenzione cellulare verso una migliore stabilità dell’endotelio. È stato proposto un approccio accoppiato tra la classica ingegneria dei tessuti e un modello computazionale per la stima a priori di un condizionamento meccanico fisiologico del costrutto da ingegnerizzare. La strategia adottata permette di: (1) aumentare lo scambio di massa in scaffold tridimensionali (3D) per ottimizzare il microambiente biochimico, (2) stimolare biomeccanicamente il graft con una perfusione pulsatile predetta da un modello computazionale e (3) imitare la struttura stratificata dei vasi sanguigni con uno scaffold polimerico ricoperto con gel. A tal proposito, l’esposizione alternata ad aria e mezzo di coltura, accoppiata con un flusso convettivo dovuto alla rotazione longitudinale, permette di migliorare in maniera efficace lo scambio di massa anche in costrutti porosi 3D, con vantaggi in termini di metabolismo cellulare e colonizzazione dello scaffold grazie all’apporto di nutrienti e ossigeno nelle strutture più profonde del costrutto. L’efficienza di tale fenomeno, qui dimostrata su schiume poliuretaniche, è assicurata quando la dimensione dei pori è almeno di 68 µm e in presenza di un altro rapporto tra la dimensione dei pori e di quella della cellula endoteliale. Per quanto riguarda le stimolazioni meccaniche, un modello scaffold-specifico di interazione fluido struttura (FSI) è stato sviluppato come stumento utile per la stima di deformazioni circonferenziali e sforzi di taglio alla parete agenti rispettivamente su cellule muscolari lisce della parete dei vasi (VSMC) e sulle endoteliali (EC). In base ai risultati ottenuti e a partire dalle proprietà meccaniche dello scaffold stesso, il modello permette di determinare a priori il pattern meccanico ottimale per stimolare fisiologicamente il sistema scaffold-cellule, andando a modulare le portate in ingresso al sistema, specialmente nel caso di scaffold viscoelastici. Per analizzare il comportamento cellulare in risposta al pattern meccanico di stimulazione definito tramite il modello FSI, sono stati eseguiti esperimenti di coltura dinamica in perfusione pulsatile su vene ombelicali umane decellularizzate (dHUV) seminate con EC. I risultati confermano la capacità del modello di predire le pressioni e le deformazioni circonferenziali; al contrario, il comportamento cellulare in termini di sforzo di taglio deve essere ancora investigato. Per quanto riguarda la perfusione di scaffold porosi, è stato sintetizzato un coating di gel a base di alginato (8% w/v) e gelatina (6% w/v), funzionalizzato con finbronectina, in grado di prevenire perdite di fluido attraverso le strutture porose dello scaffold tubolare grazie alle proprietà reticolanti dell’alginato. La capacità di indurre adesione cellulare da parte della gelatina, ulteriormente migliorata dalla presenza della fibronectina, permette alle EC di aderire e di interagire con il gel sottostante. Il coating superficale di gel che occlude i pori del lume senza penetrare nello spessore dello scaffold tubolare garantisce la formazione di una struttura 3D a doppio strato, che riproduce l’organizzazione di un vaso sanguigno sano. Lo scaffold così ottenuto risulta promettente per mantenere anatomicamente separata la superficie del lume dalla tunica media, pur mantenendole funzionalmente in contatto. In conclusione, questo progetto di ricerca ha posto le basi per lo sviluppo in vitro di TEBV funzionali non immunogenici, in relazione a due aspetti fondamentali: (1) l’ottimizzazione e il controllo a priori dell’ambiente biochimico e degli stimoli biomeccanici e (2) la produzione di scaffold tubolari a doppia struttura con alto potenziale per promuovere l’adesione endoteliale nel lato lume e la colonizzazione da parte delle VSMC della struttura esterna porosa, mantenendo le cellule separate all’interno delle due strutture.