Engineered alginate microspheres for the delivery of pro-angiogenic growth factors

Introduction Angiogenesis is the physiological phenomenon leading to the formation of new vessels from preexisting vasculature. The need to stimulate appropriate vascularization has resulted in a strong limit to practical applications in both the fields of regenerative medicine and tissue engineering, leading to an interest in strategies for the induction of angiogenesis. Furthermore, it has been found that treatment of ischemic diseases, or the regeneration of trauma induced lesions (i.e. bone fractures) can be aided by regenerating the damaged vascular network, and thus reinstating appropriate blood flow to the pathological region. Engineered tissue constructs depend on an appropriate mass transfer mechanism to permit survival of the forming tissue, and to maintain a homogenous cellular phenotype throughout the thickness of the construct. Integration of a vascular network within a growing construct would allow for improved nutrient and oxygen transfer, with the possibility of removing dimensional limitations, given a sufficiently high vessel density. In both fields, integration of a regenerative device or engineered tissue with a host organism can be greatly aided by a preexisting vascular network capable of interfacing itself with the that of the host. Growth factors are the key signaling molecules of the angiogenic process. Many different growth factors have been identified in relation to their role in forming and developing new vasculature. Amongst these growth factors, those belonging to the family of vascular endothelial growth factor (VEGF) stand out as the most influential and researched for therapeutic application. VEGF165, an isoform of human vascular endothelial growth factor, is of particular interest because of its potent capacity to stimulate endothelial cell migration, proliferation, and ability to assemble into vascular lumens, forming an immature network. Other growth factors have been employed to stimulate maturation of the forming vascular plexus, which include morphogens such as TGF-β and Sonic Hedgehog, but also platelet derived growth factor (PDGF) for the recruitment and activation of pericyte cells, which play a fundamental role in vessel maturation. Alginate is an anionic natural polysaccharide capable of forming hydrogel networks in presence of bivalent cations, such as Ca2+. Alginate hydrogels have been employed in many biomedical applications, but result prominently in their use as cell scaffolds and drug delivery systems. Alginate polymers are highly biocompatible, as most natural polymers, and their delicate gelling conditions don’t require the use of potentially toxic crosslinking agents, resulting in highly hydrated networks ideal for the encapsulation of cells and water soluble molecules. This project employed different calcium ion sources for alginate gelation: calcium chloride (CaCl2) is highly soluble in water, and dripping an alginate solution into a CaCl2 bath results in a very quick gelation of the outer layers, yielding spheres with crosslinked shell, with a thickness depending on exposure time to the calcium bath; this process is generally referred to as “external gelation”. Calcium carbonate (CaCO3), on the other hand, presents very low water solubility, and thus can be mixed into an alginate solution. Calcium ion can be released when the salt is exposed to an acid environment. Commonly employed acidifying agents for polymer crosslinking are acetic acid and gluconic-delta-lactone (GDL), which lead a slow release of calcium ions, and gradual and homogenous crosslinking of the gel; this process is generally referred to as “internal gelation”. This thesis aims at developing engineered alginate microspheres to serve as growth factor delivery systems for both therapeutic angiogenesis and tissue engineering applications. Engineering strategies involve multiple approaches, from modification of the production process and thus the properties of the obtained microspheres, to incorporation of different polymers within the alginate hydrogel networks to alter protein release kinetics. Macrospheres were used as an initial model to study the extrusion process and the release kinetics of two water soluble molecules employed as model molecules: procaine and bovine serum albumin (BSA). Cellular assays were performed to evaluate the biological effects obtainable through different engineering strategies. Materials and Methods Macrospheres were produced by extrusion through a 20-gauge syringe needle of 2% (w/v) alginate and calcium carbonate (CaCO3) aqueous solution into 1 molar calcium chloride (CaCl2) baths. A second crosslinking process was then initiated by administration of an acid solution, either by immersion of macrospheres into a hydrochloric acid bath, or by adding 10 mg/mL of and aqueous GDL solution to the alginate-CaCO3 mixture before extrusion. CaCO3 powders were produced either by manually grinding CaCO3 grains or chemically by mixing aqueous solutions of CaCl2 and NaCO3. Calcium particulate was analyzed through optical imaging. Macrosphere release studies were conducted in distilled water; protein and procaine measurements were performed using UV spectroscopy at 280 and 207 nm for BSA, and at 292 nm for procaine. Microsphere extrusion was performed using a VarJ30 bead generator, starting from an alginate solution in purified H2O. Gelation was obtained by spraying into a CaCl2 bath. Different samples were produced, some undergoing multiple crosslinking procedures, while the rest where produced under form of semi-interpenetrated networks with poly(ethylene glycol) (Mw 8000) at increasing concentrations. Samples containing 0.1% sulfated-PEG (Mw 500) were also produced. Microsphere morphology and dimensions were analyzed using optical microscopy. Release studies were performed using BSA as a model protein, and quantified using a Bicinchoninic Acid protein assay (BCA). The following table reassumes the microsphere samples produced, their components and respective concentrations.Biological activity and angiogenic potential of microspheres loaded with VEGF165 was evaluated using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) based assays. Assays were performed seeding cells into gelatin coated 24 well-plates, and cultivating overnight in EGM-2 endothelial growth media prior to media substitution and performing the test. Migration and proliferation assays were performed by substituting growth media with a growth media deprived of both VEGF and basic fibroblast growth factor (bFGF). Cell density was set to 1000 cells/cm2 and 44000 cells/cm2 for each respective assay. 18 mg of microspheres contained in transwells were placed inside the wells. Migration and proliferation assays employed sample types D and A at a concentration of 0.5 µg/mL of VEGF, whereas migration assays also presented samples containing 4 µg/mL of VEGF. Unloaded microspheres were also employed, but in this case cultivation took place in EGM-2 complete media and EBM-2 basal media, and served the purpose of control samples. Results Macrosphere extrusion demonstrated the feasibility of production using a double-crosslinking method, employing both GDL or HCl as an acidifying agent, whereas the inclusion of ethanol as solvent in the gelation bath resulted in changes of dimensions and appearance of macrospheres. Calcium carbonate particle production resulted in spherical crystals with a smaller diameter compared to ground CaCO3, making it a more appropriate candidate for use in double-crosslinked microspheres. Microsphere production required adaption for double-crosslinked samples, which led to a decrease in resulting gel mechanical properties, and an elongation of the gelation kinetic necessary to permit sphere extrusion. Alginate-PEG blends were extrudable into calcium chloride baths to form semi-interpenetrated networks up to a PEG concentration of 30%, after which solution viscosity resulted in obstruction of the bead generator nozzle. Morphological assessment and dimensional analysis showed that all microspheres presented a monodisperse diameter distribution, centered around 60 µm. Optical imaging showed a similar morphology between samples, with calcium carbonate crystals clearly visible in double-crosslinked microspheres, and PEG-alginate spheres presenting a less homogenously rounded shape. Release studies from macrospheres showed an extension of the release kinetic of procaine for spheres crosslinked both externally and internally with either HCl or GDL. The employment of GDL resulted in a much lower molecular release into the CaCl2 gelling bath. The same effect was visible with BSA, were an extension of release was visible up to 4 days from production. Microsphere release studies showed that inclusion of an additional crosslinking process, and the production of semi-IPNs both resulted in an extension and intensification of the release phenomenon compared to alginate microspheres. PEG semi-IPN produced a particularly extended release, with BSA detectable after 7 days. The combination of sulfated PEG and alginate failed to release detectable amounts of protein compared to controls. In vitro cellular migration assays showed a general trend of strong migration after 1 day of exposure to loaded microspheres, in concomitance to burst release from microspheres. Growth factor concentration proved to be a factor in determining migration speed, especially around day 1, while the overall area colonized did not depend on the concentration or even presence of VEGF. Samples D (20% PEG) seemed to elicit a stronger response compared to unmodified alginate, yet statistical uncertainty was too high to draw any certain conclusions. Proliferation assay data shows that PEG-alginate microspheres induced a higher proliferation rate, whereas alginate microspheres had a similar effect only during the first day of the experiment. Conclusions Extrusion of double-crosslinked microspheres was achieved successfully; microspheres presented a stronger initial burst phase, but also an extended release window, as did alginate-PEG semi-IPNs. Sulfated PEG-alginate blend microspheres require further characterization before it is possible to judge their efficacy as a growth factor delivery system. Cellular assays show that VEGF165 incorporation into alginate and alginate-PEG microspheres does not compromise protein integrity, and suggest that PEG-alginate spheres induce a stronger angiogenic response, in the aspects of endothelial cell migration and proliferation.

Introduzione L’angiogenesi è il processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi plessi vascolari a partire dalla vascolatura pre-esistente. Essa è di interesse per applicazioni nei campi della medicina rigenerativa e dei tessuti ingegnerizzati. Infatti, l’inadeguatezza dei sistemi di trasporto di massa nei tessuti ingegnerizzati e costrutti impiantabili si è rivelata un forte limite tecnico in entrambi i campi. I tessuti ingengerizzati dipendono da un apporto nutritivo e un tenore di ossigeno adeguato per consentire la soppravivenza degli strati cellulari nello spessore del costrutto, e per mantenere una distribuzione homogenea di densità e fenotipo cellulare. La generazione di una rete vascolare dalla densità adeguata potrebbe comportare la rimozione dei limiti dimensionali attualmente vigenti durante la progettazione di un costrutto cellulare, facilitando anche l’integrazione del costrutto con il tessuto nativo, migliorandone la soppravivenza cellulare. Inoltre, approci terapeutici della medicina rigenerativi volti al trattamento di patologie ischemiche o lesioni traumatiche (quali le lesioni ossee), possono essere implementati rigenerando la struttura vascolare, reinstaurando un flusso sanguigno appropriato nella regione patologica. I fattori di crescita sono molecole che svolgono una funzione segnaletica predominante nel processo angiogenico. Sono state identificate numerose famiglie proteiche in base al loro ruolo nella formazione, nell sviluppo e maturazione di un nuovo sistema vascolare. Tra queste molecole, la famiglia del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è stata riconosciuta per il suo ruolo come il più potente segnale angiogenico. L’isoforma 165 del VEGF è ampiamente studiata per via della sua capacità di stimolare fenomeni di migrazione, proliferazione e assemblamento di lumi vascolare da parte di cellule endoteliali vascolari, processi fondamentali per la formazione di una struttura vascolare immatura. Altri fattori di crescita possono potentialmente essere impiegati per consentire la maturazione del plesso vascolare nascente. Tali fattori includono elementi morfogeni, come il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) e il Sonic Hedgehog, o fattori coinvolti nel reclutamento e nell’attivazione dei periciti, come il fattore derivato dalle piastrine (PDGF). L’alginato è un polisaccaride naturale anionico capace di generare idrogeli in presenza di cationi bivalenti, quali gli ioni Ca2+. Gli idrogeli a base di alginato sono ampiamente impiegati nel campo biomedicale, ma sono usati soprattutto per la produzione di costrutti cellulari e sistemi per il rilascio di farmaci. Gli alginati sono polimeri altamente biocompatibili, come la maggior parte dei polimeri naturali, e le condizioni di gelazione delicate non richiedo l’impiego di agenti reticolanti tossici, formando reticoli gel idratati ideali per l’incapsulamento di cellule o di molecole idrosolubili. In questo lavoro sono state utilizzate due delle molteplici fonti di ioni calcio disponibili per la gelazione dell’alginato: il calcio cloruro è altamente solubile in acqua, e gocce di alginato possono reticolare velocemente se immerse in una sua soluzione acquosa. Questo processo viene generalmente indicato con il termine “gelazione esterna”, caratterizata da una cinetica rapida e una reticolazione poco omogenea. L’altra fonte è il calcio carbonato, un sale di calcio poco solubile in acqua, che può essere sospeso in una soluzione di alginato senza avviare il processo di reticolazione. La liberazione di ioni calcio avviene in ambiente acido. Nel campo biomedico vengono spesso impiegati agenti acidificanti quali l’acido acetico e l’acido gluconico-delta-lattone, che portano ad un rilascio lento e graduale di ioni calcio, generando un gel omogeneo. Questo processo è generalmente denominato “gelificazione interna”. Questo progetto si prefigge lo scopo di ingegnerizzare un sistema a base di microsfere di alginato per il rilascio di fattori di crescita, e in particolare del VEGF per una ampio range applicativo, dall’angiogenesi a scopo terapeutico all’ingegneria dei tessuti. Il processo ingegneristico si basa su diversi approci, dalla modifica del processo di produzione e gelificazione delle microsfere, allo sviluppo di sistemi semi-interpenetrati al fine di alterare la cinetica di rilascio proteico. Lo studio del processo di estrusione è stato effettuato impiegando un modello di sfera macroscopico, applicato poi alle microsfere. Lo studio dei rilasci è stato effettuato impiegando due molecole, la procaina e l’albumina da siero bovino (BSA). Al fine di valutare l’attività biologica delle microsfere ingegnerizzate verrano condotti i test cellulari associati al processo angiogenico, come test di migrazione e di proliferazione di cellule endotheliali umane. Materiali e Metodi Le macrosfere sono state prodotte per estrusione attraverso una siringa da 20-gauge di una soluzione di alginato e calcio carbonato (CaCO3) 2% (w/v) in una soluzione 1 molare di calcio cloruro (CaCl2). Avendo lasciato gelificare per 15 minuti, un secondo processo di gelificazione è stato avviato per esposizione ad un acificante, sotto forma di una soluzione di HCl o in contemporanea alla gelificazione in CaCl2 tramite aggiunta di 10mg/mL di GDL alla soluzione di alginato. Polveri di CaCO3 sono state prodotte per macinazione manuale di grani, o tramite un processo chimico, mischiando soluzioni acquose di CaCl2 e NaCO3. Il particolato è stato analizzato utilizzando microscopia ottica. Le prove di rilascio da macrosfere sono state condotte in acqua distillata, e il rilascio di due molecole, procaina e BSA, è stato quantificato tramite spettroscopia UV a 292 nm per la procaina e 207 e 280 per la BSA. L’estrusione di microsfere è stata effettuata mediante l’uso di un generatore di gocce VarJ30, partendo da una soluzione di alginato in acqua purificata. La gelazione è avvenuta per immersione delle gocce in un bagno di CaCl2. Sono stati prodotti campioni di diversa natura, impiegando le due tecniche di reticolazione, oppure additivando le soluzioni di alginato con una percentuale (w/v) di polietilenglicole (PEG, Mw: 8000). Infine sono stati prodotti campioni contententi 0.1% (w/v) di PEG solfato (Mw: 500). Gli studi di rilascio sono stati effettuati utilizzando la BSA, e la quantificazione è avvenuta tramite un saggio proteico a base di acido bicinconinico (BCA). La tabella seguente illustra i campioni prodotti sotto forma di microsfere, con le relative concentrazioni di reagenti.L’attività biologica e il potenziale angiogenico delle microsfere caricate con VEGF165 è stato valutato utilizzando saggi cellulari impieganti cellule endoteliali umane da vena ombelicale (HUVECs). I saggi sono stati effetuati seminando cellule su piastre da coltura cellulare da 24 pozzetti funzionalizzate con gelatina, e lasciando incubare per una notte in un mezzo di crescita per cellule endoteliali, l’EGM-2. Saggi di migrazione e proliferazione sono stati condotti sostituendo il mezzo di crescita con una versione deprivata di sia VEGF165, che il fattore di crescita di fibroblasti basale (bFGF). Le cellule sono state seminate con una densità di 44 mila cellule/cm2 e di 1000 cellule/cm2 rispettivamente per i saggi migratori e proliferativi. 18 mg di microsfere contenute nel fondo di transwell sono state poste nei pozzetti. Le prove sono state effetuate utilizzando campioni di tipo A e D, con una concentrazione di VEGF di 0.5 µg/mL e di 4 µg/mL (solo saggio migratorio), oltre a sfere prive di fattori di crescita. Nel caso delle sfere scariche, la coltura è stata effettuata in mezzo di crescita completo e mezzo basale (EBM-2), svolgendo il ruolo di campioni di controllo. Risultati L’estrusione di macrosfere ha dimostrato la fattibilità della produzione tramite un doppio processo di gelazione, impiegando o GDL o HCl come agente acidificante, mentre l’inclusione di etanolo come solvente nel bagno di gelazione, ha generato sfere dalle dimensioni e dall’aspetto alterato. La produzione di particelle di calcio carbonato è risultata in cristalli dalla forma sferica con un diametro minore rispetto al calcio carbonato macinato, rendendolo un candidato migliore per l’impiego nel processo di gelazione interna. La produzione di microsfere ha richiesto un processo di adattamento per campioni a doppia reticolazione, che ha comportato un peggioramento delle proprietà meccaniche dei gel, ma anche un allungamento della cinetica di reticolazione, necessario per consentire l’estrudibilità. Miscele di alginato e PEG sono state reticolate in bagni di calcio cloruro, formando strutture semi-interpenetrate. L’estrusione è risultata possibile fino ad un tenore di PEG del 30%-40%, dopo cui la viscosità eccessiva della soluzione ha comportato l’ostruzione del becco. Valutazioni morfologiche e dimensionali hanno mostrato che i processi risultano in una popolazione di microsfere con misure dei diametri distribuiti in maniera monodispersa, centrate attorno ad un valore di 60 µm. La morfologia è risultata conservata tra campioni, con differenze dovute alla presenza di cristalli di calcio carbonato nei campioni a doppia reticolazione e i campioni in PEG-alginato hanno mostrato una forma meno arrotondata e omogenea. Prove di rilascio da macrosfere mostrano un allungamento della cinetica di rilascio della procaina per sfere a doppia reticolazione. L’uso del GDL ha inoltre comportato un rilascio molto minore durante il processo di gelazione esterna nel bagno di calcio cloruro. Sono stati riscontrati risultati analoghi anche per il rilascio di BSA, in cui è stata rilevata un’estensione della cinetica osservabile fino a 4 giorni dall’inizio della prova. Prove di rilascio condotte con microsfere ingegnerizzate hanno mostrato una intensificazione del fenomeno di rilascio, oltre ad un allungamento temporale della cinetica. Il profilo presenta un forte rilascio nelle prime ore (burst release), seguito da una cinetica molto più lenta nei giorni successivi. Questi fenomeni sono stati riscontrati sia in campioni contenenti PEG, sia in quelli sottoposti a doppia gelazione, mentre non è stato osservato nessun miglioramento della cinetica per campioni prodotti con PEG solfato. Il rilascio da campioni alginato-PEG è risultato particolarmente intenso ed esteso, arrivando a rilasciare il 90% della proteina incorporata, con un rilascio rilevabile dopo 7 giorni dall’inizio della prova. I saggi cellulari in vitro di migrazione hanno mostrato un forte fenomeno migratorio nell’intorno del giorno 1 dell’esperimento, in concomitanza con il forte rilascio iniziale dalle microsfere. La concentrazione del fattore di crescita delle microsfere ha un effetto apprezzabile sulla velocità di migrazione iniziale, anche se tutti i campioni, anche quelli coltivati in mezzo cellulare basale, colonizzano per intero la regione del graffio. Campioni di tipo D (PEG 20%), sembrano generare una risposta migratoria maggiore in confronto a sfere non modificate, ma non è possibile trarre conclusioni definitive data l’elevata incertezza statistica. I saggi proliferativi hanno mostrato un comportamento marcatamente diverso tra campioni di tipo A (alginato) e D (alginato-PEG 20%). Entrambi hanno generato un forte stimolo proliferativo, che campioni di alginato-PEG hanno poi riattivato nei giorni seguenti, mentre i campioni di alginato hanno generato una risposta paragonabile ai controlli in seguito al giono 1. Conclusioni L’estrusione di microsfere ingegnerizzate a doppia gelazione è stata realizzata con successo, e il loro rilascio è risultato più intenso, con una cinetica più lunga, indicandone la possibilità di impiego come sistema per il rilascio prolungato di fattori crescita. Microsfere con sistemi semi’IPN di PEG hanno mostrato risultati analoghi e in generale superiori, inducendo un allungamento della cinetica di rilascio da poche ore ad oltre una settimana. L’inclusione di PEG solfato in microsfere di alginato non è risultata in un migliornamento della cinetica di rilascio. Saggi cellulari mostrano che l’inclusione di VEGF165 all’interno di microsfere di alginato e alginato-PEG non comporta una degradazione della proteina e che essa è in grado di indurre uno stimolo angiogenico. I saggi cellulari indicano inoltre che microsfere a base di alginato-PEG sono in grado di fornire indurre fenomeni migratori e proliferativi più veloci rispetto a microsfere di alginato, purchè senza certezza statistica, motivo che suggerisce la necessità di proseguire lo studio di questi sistemi per applicazioni nel campo della medicina rigenerativa e nell’ingegnerizzazione dei tessuti.