A structural approach towards cell adhesion modulation and protein engineering

Protein X-ray crystallography is a very powerful tool that provides, at the molecular level, the high quality and high resolution structural information that is necessary for structure-function correlation analysis, protein engineering, structure based drug design and molecular dynamics (MD) simulations. In this thesis, this technique has been extensively used for the investigation of the structure, properties and possible application of the extracellular portion of some selected cell-adhesion proteins of the type I classical cadherin family and of a deglycating enzyme from the large Fructosyl Amino Oxidase family, called Amadoriase I. Cadherins are calcium-dependent trans-membrane proteins that comprise three clearly discernible regions: intracellular, trans-membrane and extracellular. The extracellular portion is formed by a variable number of so-called extracellular cadherin (EC) repeat domains, each formed by approximately 110 amino acidic residues and rigidified by the presence of Ca2+ ions between them. They are of critical importance for cell-cell adhesion, a fundamental process that results in cellular organization and tissue differentiation, thus allowing the formation of tissues and organs and ultimately the development of complex multicellular organisms. Other than their adhesive function, cadherins also perform a cell-cell signaling function. It is well known that variations in cadherin natural expression level and changes in their ability to form either homophilic dimers or bind to selected protein substrates correlate with the onset and the progression of diseases such as cancer, asthma and chronic inflammation states. Although the cadherin main functions (adhesion and signaling) have been quite extensively investigated over the last two decades, the mechanism by which such tasks are performed still needs to be fully elucidated. Over time, a combination of biophysical techniques (mainly X-ray diffraction, NMR and SAXS) have provided a clear, albeit still incomplete, picture of the adhesion mechanism, leaving the complete trajectory that leads, very dynamically, from the monomer to the dimeric adhesive state and back still partially elusive. The implications of such lack of complete structural characterization are important: to date, no clear molecular bases for cadherin homo-selectivity and for their energy activation profiles have been unambiguously identified. In this thesis work, I have studied selected cadherin family members at the molecular level by single crystal X-ray crystallography. Overall, my goal was to contribute to the characterization of their adhesion mechanism. Furthermore, in the context of this thesis, I combined this structural analysis with biophysical, computational and functional studies aimed at the development or the identification of molecules that are capable of modulating cadherin homophilic adhesion. Finally, starting from the structural information, I have engineered a cadherin family member with the goal of producing XIII functionalized biomaterials. In fact, due to the important role of the protein in tissue sorting and formation, such cadherin-functionalized hybrid materials may be employed as scaffolds in tissue engineering and tissue regeneration or be used for the development of cell-sorting or sensing lab-on-chip platforms. The second project that I focused on in my thesis is the X-ray crystal structure of the deglycating enzyme Amadoriase I. A member of the Fructosyl Amino Oxidase family, this enzyme is capable of hydrolyzing the bond between the amine and the sugar moiety of a glycated amino acid. From a biomedical point of view, the study of this enzyme is very important since protein glycation reactions occur spontaneously in the body over time due to the sugar present in blood. As a result of this spontaneous glycation reaction (usually referred to as the Maillard reaction) proteins are progressively glycated and, especially those with long half-life, tend to become heavily crosslinked over time. These non specific modifications negatively affect the function of the proteins and may eventually lead to the development of diseases such as Alzheimer’s disease, arteriosclerosis, nephropathy and retinopathy, with a higher incidence in elderly people and in people with abnormally high blood sugar levels. Moreover, deglycating enzymes are also utilized for the measurement of the concentration of the glycated form of hemoglobin (HbA1c) in the blood. In fact, due to the relatively long life-time of hemoglobin (90-120 days) and therefore its tendency to be glycated over time, this is a very good indicator of the concentration of blood glucose over a period of 2-3 months. Unfortunately, however, due to the fact that the available enzymes only work on glycated amino acids, this process is not immediate since HbA1c must be proteolytically cleaved before the enzymatic detection of selected glycated amino acids can actually take place. During my thesis, I contributed to the structural characterization of of the apo form and the substrate-bound form of Amadoriase I from Aspergillus fumigatus. Moreover, I have been actively involved in the first attempts to engineer this enzyme in order to enhance its natural substrate recognition capabilities. All these studies have been conducted using a combination of molecular biology, protein chemistry, X-ray crystallography and molecular dynamics techniques. The ultimate goal with this project is to engineer the Amadoriase I enzyme in order to enlarge its catalytic cavity and allow its catalytic activity on large substrates such as polypeptides or even whole glycated proteins. This would, for instance, potentially improve the current procedures employed for the measurement of HbA1c in diabetic patients, possibly leading to new, efficient and low cost diagnostic tools for diabetes monitoring. Other potential applications of such molecular technology include the use of such chimeric enzyme to slow or even reverse collagen rigidification in aging tissues as well as in the food industry, to limit protein glycation in aliments that need thermal treatment (e.g. UHT milk).

La cristallografia a raggi-X di proteine è uno strumento estremamente potente che fornisce le informazioni di alta qualità e risoluzione che sono necessarie per effettuare analisi di correlazione struttura-funzione, ingegnerizzazione di proteine, sviluppo di farmaci basato sulla struttura molecolare dei bersagli e simulazioni di dinamica molecolare. Per il lavoro di tesi questa tecnica è stata estensivamente utilizzata per l'indagine su struttura, proprietà e possibili applicazioni della porzione extracellulare di alcuni membri selezionati della famiglia di proteine di adesione cellulare delle caderine di tipo I e di un enzima deglicante, l'Amadoriasi I, appartenente alla grande famiglia dei Fruttosil-Amino Ossidasi. Le caderine sono proteine calcio-dipendenti di adesione cellulare, la cui struttura può essere distinta in tre porzioni: intracellulare, trans-membrana ed extracellulare. Quest'ultima porzione è formata da un numero variabile di domini chiamati extracellular cadherin repeats (EC), ciascuno formato da circa 110 amminoacidi, e resa rigida dalla presenza di ioni Ca2+ tra di essi. Queste proteine sono di vitale importanza nell'adesione tra le cellule, un processo fondamentale che risulta nell'organizzazione delle cellule e nella differenziazione dei tessuti, permettendo la formazione di organi ed infine lo sviluppo di organismi multicellulari complessi. Oltre alla loro funzione adesiva, le caderine sono coinvolte anche nella comunicazione cellulare. Infatti, è noto che la naturale variazione dei livelli di espressione delle caderine e la variazione della loro capacità di formare legami omofilici o di legarsi a determinati substrati correli con lo svilupparsi ed il progredire di patologie come cancro, asma e stati cronici d'infiammazione. Nonostante nelle ultime decadi le funzioni principali delle caderine (adesione e comunicazione) siano state estensivamente studiate, il meccanismo con cui queste funzioni vengono espletate non è ancora stato completamente delucidato. Nel tempo, una combinazione di metodi biofisici (soprattutto diffrazione dei raggi-X, NMR e SAXS) hanno fornito un quadro piuttosto chiaro, seppur incompleto, del meccanismo di adesione anche se la traiettoria che, in modo molto dinamico, va dallo stato monomerico a quello adesivo dimerico, e viceversa, rimane ancora almeno parzialmente elusiva. Le implicazioni di questa mancanza di informazioni strutturali sono importanti: ad oggi non sono ancora chiare ne le basi molecolari dietro la specificità per la formazione di omodimeri, ne i profili energetici delle energie di attivazione di questo sistema. In questo lavoro di tesi ho studiato, a livello molecolare, alcuni membri scelti della famiglia delle caderine usando la cristallografia a raggi-X, avendo come obbiettivo primario quello di contribuire alla caratterizzazione del loro meccanismo di adesione. Inoltre, sempre nel contesto della tesi, ho combinato questa analisi strutturale con studi biofisici, computazionali e funzionali, mirati allo sviluppo e all'identificazione di molecole in grado di modulare l'adesione omofilica di queste proteine. Infine, partendo dalle informazioni strutturali, ho provveduto ad ingegnerizzare uno dei membri della famiglia delle caderine con lo scopo di realizzare un biomateriale funzionalizzato. Infatti, visto il ruolo che rivestono nella formazione e differenziazione dei tessuti, tali materiali ibridi funzionalizzati con le caderine potrebbero trovare un utilizzo come scaffolds nell'ingegneria e rigenerazione tissutale o essere usati mer lo sviluppo di piattaforme lab on chip per la classificazione o la detection di cellule. Il secondo progetto su cui mi sono focalizzato durante il lavoro di tesi è stato la determinazione della struttura ai raggi-X dell'enzima deglicante Amadoriasi I. Membro della famiglia dei Fruttosil Amino Ossidasi, questo enzima è in grado di idrolizzare l legame tra un'ammina ed uno zucchero di un amminoacido glicato. Dal punto di vista biomedico, lo studio di quest enzima è molto importante dato che la reazione di glicazione avviene spontaneamente nel corpo a causa degli zuccheri trasportati dal sangue. A causa di questa reazione (detta anche reazione di Maillard), le proteine vengono progressivamente glicate e, specialmente nel caso di quelle che hanno una lunga emivita, nel tempo tendono a diventare pesantemente crosslinkate. Queste modifiche non specifiche, oltretutto, compromettono la normale funzione delle proteine e possono eventualmente portare all'insorgere di malattie come morbo di Alzheimer, arteriosclerosi, nefropatie e retinopatie, con un incidenza maggiore negli anziani e nelle persone con livelli medi di zucchero nel sangue aberrantemente alti. Inoltre, gli enzimi deglicanti sono anche usati nella misura della concentrazione di emoglobina glicata nel sangue (HbA1c). Infatti, grazie alla sua relativamente lunga emivita (90-120 giorni), e quindi allal tendenza a glicarsi nel tempo, questa molecola è un ottimo indicatore della concentrazione nel sangue su un periodo di 2-3 mesi. Sfortunatamente, però, poiché i pochi enzimi disponibili funzionano solamente su amminoacidi glicati, questo processo non è immediato poiché HbA1c deve prima essere proteoliticamente degradata prima di poter misurare la concentrazione degli amminoacidi glicati d'interesse. Durante il mio lavoro di tesi ho contribuito alla caratterizzazione strutturale dell'Amadoriasi I da Aspergillus fumigatus sia nella sua forma apo che in complesso col suo substrato. Inoltre sono anche stato attivamente coinvolto nei tentativi preliminari di ingegnerizzarlo in modo da migliorare le sue capacità di riconoscimento del substrato. Questi studi sono stati condotti usando una combinazione di biologia molecolare, chimica delle proteine, cristallografia a raggi-X e tecniche di dinamica molecolare. L'obbiettivo finale di questo progetto è di ingegnerizzare l'Amadoriasi I in modo da allargarne il sito attivo e permetterne l'attività anche su substrati più grandi quali polipeptidi o perfino proteine glicate intere. Ciò renderebbe potenzialmente possibile, per esempio, il miglioramento delle correnti procedure di misura di HbA1c nei pazienti diabetici, possibilmente consentendo lo sviluppo di strumenti diagnostici per il controllo del diabete nuovi, efficienti ed a basso costo. Un'ulteriore potenziale applicazione di questa tecnologia include l'uso di questo enzima per rallentare, se non invertire, la rigidificazione del collagene che avviene nei tessuti con l'invecchiamento oppure nell'industria alimentare per limitare la glicazione delle proteine negli alimenti che vengono sottoposti a trattamenti termici (es. latte UHT).