Electrospinning of biopolymers for regenerative medicine

Extra-cellular matrix (ECM) is a three-dimensional structure constituted by interconnected nanofibers, which serves as scaffold for cell proliferation and plays also an important role in tissue function. ECM is composed of several types of proteins, polysaccharides and glycoproteins. In tissue engineering field, a scaffold with adequate composition and properties is fundamental to favor physiological healing process and successful outcome. In this regard, electrospinning (ES) represents a valuable fabrication technique, as it allows the production of nanofibers in a simple and convenient way; moreover, natural polymers, and in particular ECM biopolymers, can be processed by ES, thus allowing the fabrication of membranes whose chemical composition and morphology closely resemble those of physiological ECM. Several studies in literature have focused their attention on ES of biopolymers; however, some limitations remain, as solvents commonly used for ES are not necessary good solvent for natural polymers and they can be toxic or cause extensive molecule denaturation, biopolymer solutions usually lack viscoelastic properties essential for a stable ES, and finally, a crosslinking post-treatment, which is necessary to improve matrix stability, may introduce cytotoxic residues. Therefore, more detailed comprehension and study on biopolymer ES are necessary in order to elucidate possible solutions, thus leading to production of membranes with a tremendous potential as scaffold for tissue engineering. In Chapter 1, ECM composition and function were reviewed, and the most studied strategies for ECM mimicry were presented. Then, ES process was described, and the influence of several parameters on the process outcome was discussed. Particular attention was dedicated to ES of natural polymers and the relative characterization techniques commonly used in literature. In the second Chapter, the most abundant ECM macromolecules (i.e. collagen/gelatin, elastin and hyaluronic acid) were used to obtain different composition blends, and their ES process was optimized in order to produce electrospun matrices with tunable composition that closely mimics ECM of different tissues. The use of a non-fluorinated solvent, namely formic acid, for solution preparation was advantageous in reducing both toxicity and cost of the process with respect to the solvents commonly used in literature for biopolymer ES (i.e. hexafluoroisopropanol, HFIP, and trifluroethanol, TFE). Influence of collagen batch variability on ES process was also evaluated. Finally, the efficacy of the most common crosslinking methods for natural polymers was compared by evaluating matrix morphology and stability. The third Chapter is dedicated to the ES of fibrinogen, which has a major role in clot formation and physiological tissue repair, and of fibrinogen/gelatin blend. For the first time fibrinogen was successfully electrospun by means of an acidic solvent system composed of formic and acetic acids, instead of the commonly used HFIP. However, fibrinogen solution gelification at the tip of the spinneret occurred, thus hindering process continuity. As it was not possible to solve this problem, an alternative solution consisted in electrospinning a blend of fibrinogen/gelatin (1/1). Moreover, solution gelification phenomenon was investigated in details, and in particular the effect of acidic pH on fibrinogen molecular structure was examined by means of experimental and computational studies, which elucidated the denaturing effects of the solvent used for ES on the biomolecule. In Chapter 4 a variation of traditional ES technique, namely co-axial ES, was used to obtain core-shell fibers with application in wound healing. In particular, gelatin and hyaluronic acid were used as core and shell materials, respectively; moreover, CCG-203971 drug to prevent myofibroblast differentiation, which is responsible for excessive scar formation during wound healing, was loaded within the fiber core. The membranes were crosslinked by glutaraldehyde vapor, and influence of different process durations on electrospun matrix chemical structure were investigated. Finally, in vitro drug release and cell tests were carried out in order to evaluate the feasibility of drug-loaded bicomponent fibrous membrane for the application intended.

La matrice extra cellulare (ECM) è la struttura tridimensionale, formata da fibre interconnesse, che funge da impalcatura per le cellule e svolge un ruolo fondamentale nel determinare la funzione dei tessuti connettivi. Essa è costituita da diverse tipologie di proteine, polisaccaridi e glicoproteine. Nel campo dell’ingegneria dei tessuti, uno scaffold con composizione e proprietà adeguate è di fondamentale importanza per favorire i processi fisiologici di rigenerazione. In questo ambito, l’elettrofilatura (ES) rappresenta un’efficace tecnica di fabbricazione, poiché permette la produzione di matrici costituite da nanofibre in maniera semplice ed economica; inoltre, i polimeri naturali, e in particolare i biopolimeri della ECM, possono essere processati tramite ES, in modo da ottenere delle membrane con composizione chimica e morfologia molto simili a quelle della ECM fisiologica. In letteratura, molti lavori hanno investigato l’ES di biopolimeri; tuttavia, rimangono alcuni limiti. Ad esempio, i solventi comunemente utilizzati per l’ES non sono sempre adeguati per i polimeri naturali e possono essere tossici o causare denaturazione delle molecole; le soluzioni di biopolimeri generalmente non hanno proprietà viscoelastiche adeguate per un processo di ES stabile; infine, un post-trattamento di reticolazione, necessario per migliorare la stabilità delle matrici, potrebbe introdurre residui citotossici. Di conseguenza, una migliore comprensione del processo di ES dei biopolimeri è necessaria per trovare possibili soluzioni ai limiti sopra esposti, con il fine di produrre membrane che possano essere utilizzate come scaffold per l’ingegneria dei tessuti. Nel Capitolo 1 vengono descritte la composizione e la funzione della ECM, e le strategie più studiate per riprodurne la struttura. In seguito, viene introdotto il processo di ES, e discussa l’influenza di numerosi parametri di processo. Un’attenzione particolare è riservata all’ES di polimeri naturali e alle relative tecniche di caratterizzazione comunemente utilizzate in letteratura. Nel secondo capitolo, le macromolecole maggiormente presenti nella ECM (collagene/gelatina, elastina e acido ialuronico) vengono utilizzate per ottenere blend con diverse composizioni, e il loro processo di ES viene ottimizzato con lo scopo di produrre matrici elettrofilate con differenti composizioni che possono quindi mimare la ECM di diversi tessuti. L’utilizzo di un solvente non fluorurato, cioè l’acido formico, per la preparazione delle soluzioni risulta vantaggioso in quanto permette sia di diminuire la tossicità che il costo del processo, rispetto ai solventi comunemente utilizzati in letteratura per l’ES di biopolimeri (ad esempio l’esafluoroisopropanolo, HFIP, e il trifluoroetanolo, TFE). Infine, viene confrontata l’efficacia dei metodi di reticolazione più comunemente utilizzati in letteratura per i polimeri naturali, utilizzando come parametri la morfologia della matrice dopo la reticolazione e la sua stabilità in ambiente acquoso. Il terzo Capitolo riguarda l’ES di fibrinogeno, proteina che ha fisiologicamente un ruolo importante nella formazione dei coaguli e nella rigenerazione dei tessuti, e di blend di fibrinogeno e gelatina. Per la prima volta, il fibrinogeno viene elettrofilato utilizzando come solvente una miscela di acido formico e acetico, invece dell’HFIP solitamente utilizzato. Tuttavia, durante il processo di ES si assiste alla gelificazione della soluzione alla punta dello spinneret; questo fenomeno compromette la stabilità e la continuità del processo. Poiché non è stato possibile risolvere questo problema, una soluzione alternativa è quella di elettrofilare un blend di fibrinogeno e gelatina. Inoltre, il fenomeno di gelificazione della soluzione viene investigato più in dettaglio, e in particolare l’effetto del pH acido sulla struttura molecolare del fibrinogeno viene esaminato utilizzando metodi sperimentali e computazionali, che dimostrano come il solvente utilizzato per l’ES del fibrinogeno ne causi la denaturazione. Nel Capitolo 4 viene utilizzata una tecnica derivata dall’ES tradizionale, chiamata ES co-assiale; le fibre così ottenute hanno una struttura core-shell e vengono qui studiate per la cura delle ferite. In particolare, gelatina e acido ialuronico costituiscono i materiali rispettivamente delle fasi core e shell; inoltre, una molecola chiamata CCG-203971, in grado di inibire il differenziamento dei fibroblasti in miofibroblasti, responsabili dell’eccessiva formazione di tessuto cicatriziale durante la guarigione delle ferite, viene caricata nella fase core delle fibre. Le membrane elettrofilate così prodotte sono reticolate tramite vapori di glutaraldeide, e viene investigata l’influenza di diverse durate del processo di reticolazione sulla struttura chimica della matrice. Infine, test in vitro di rilascio della molecola e test cellulari vengono condotti per valutare l’efficacia delle membrane elettrofilate per l’applicazione desiderata.