Synthesis and characterization of polymeric nanocarriers for nanomedicine

This thesis was focused on two distinct aspects; design and characterization of injectable polymeric nanomaterials as drug delivery systems for chronic kidney diseases and design and characterization of polymeric lipid-coated nanomaterials for gene therapy. Alterations in renal functional capacity have detrimental effects in patients, which limit their quality of life, and in severe cases, lead to dialysis or kidney transplantation. Glomerular diseases are important causes of end-stage chronic kidney disease: diabetic nephropathy and immune glomerulopathies are treated with immunomodulators such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors and cytotoxic drugs, which demonstrated some efficacy but have considerable side effects. A new class of amphiphilic polymers capable to form small micelles in water and to load hydrophobic drug (such as Cyclosporine A), will be discussed. Random linear and 4-arms co-polymers constituted by hydrophobic PCL core and hydrophilic PEG shell were synthesized with different molar ratio. In particular, PCL was achieved through Ring Opening Polymerization (ROP) of ε-caprolactone; by Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) of poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMA) with PCL was possible to obtain brush-like PEG-based polymers of very well defined molecular weight and low PDI. To obtain a 4-arms architecture, polymerization of PCL-PEGMA was carried out starting from a commercial tetrafunctional initiator. This controlled synthesis allows the formation of stable ultrasmall colloidal nanomaterials of tunable size, which are compatible with kidney filtration. Secondly, a library of polymers of different molar ratio and physicochemical properties was synthesized and characterized. Thirdly, experiments of drug (cyclosporine A) loading and release were performed to assess loading capacity and release kinetics of these nanomaterials in vitro. Gene therapy could be potentially used in every genetic disease and it allows repairing genetic disorders. One approach of gene therapy relies on the knockdown of specific genes, such as the genes involved in the molecular pathway of tumour progression. One of the most promising mechanisms exploits the small interfering RNA molecules, known as siRNA. siRNA are 19-22 nucleotides long double strand RNA molecules, endogenously produced in the cytosol of cells by the enzyme Dicer, from long dsRNA (double strand RNA) or small hairpin RNA (shRNA). In the cytoplasm, siRNA binds to the RNA-induced silencing complex (RISC); this can recognize the complementary messenger RNA (mRNA) and cleaves it, preventing its translation into protein. In other words, this gene is shut off or silenced. One of the major advantages of siRNA is its potency: only few molecules are needed to obtain a strong response through a catalytic pathway. However, naked siRNA is negatively charged molecule and is not able to readily cross biological membranes, so it has limited cellular uptake; additionally, siRNA lacks biological stability and has a very short half-life in the bloodstream, due to his rapid degradation by nucleases. For the siRNA translation to the clinic, the development of an appropriate carrier that protects it from degradation, facilitate transport across vascular endothelial barrier and permits the release of cargo in the cytosol is demanding. PLGA nanoparticles functionalized with a cationic lipid 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) to efficiently deliver siRNA into cells cytosol were prepared. SiRNA was bound to the surface of particles through electrostatic interactions (complexation) giving polyplexes. Rhodamine B was also used, as model hydrophobic molecule, to evaluate encapsulation efficiency and drug loading of these carriers through UV absorbance. Nanoprecipitation was used as the main technique to functionalized PLGA as well as to encapsulate Rhodamine B. The optimization of nanoprecipitation in terms of solvent used, polymer and lipid concentration and presence of surfactants has been performed and these nanoparticles showed a high stability in water during the time. SiRNA polyplexes were tested with gel electrophoresis and with Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) to see complexation within time in HEPES buffer. Finally, these nanocarriers were also tested with biological assays for cytotoxicity and uptake in HeLa cells. All these parts were performed in collaboration with the Laboratory of General biochemistry and Physical Pharmacy of the Ghent university (Belgium) under the supervising of prof. Kevin Braeckmans and Dr. Sangram Keshari Samal.

In questa tesi si sono valutati due diversi aspetti: la sintesi e caratterizzazione di nanomateriali polimerici iniettabili come sistemi di rilascio di farmaci per la cura di malattie croniche renali e il progetto di nanomateriali polimerici funzionalizzati con lipidi per la terapia genica. Alterazioni nella capacità renale possono portare a complicanze anche gravi che limitano la qualità di vita dei pazienti e che spesso necessitano l’utilizzo di dialisi o, nei casi più gravi, del trapianto. L’approccio tradizionale per rallentare le glomerulopatie, una delle maggiori cause di insufficienza renale (ad esempio la nefropatia diabetica e le glomerulonefriti autoimmuni) è quello di utilizzare farmaci immunomodulatori come glucocorticoidi, inibitori della calcineurina o farmaci citotossici che sono efficaci ma presentano notevoli effetti collaterali. Pertanto, è stata sviluppata una nuova classe di polimeri anfifilici capaci di formare piccole micelle in acqua e di incapsulare farmaci idrofobici (come ad esempio la ciclosporina A, un immunosoppressore). Co-polimeri random sia lineari sia a 4-braccia costituiti da un cuore idrofobico di PCL (policaprolattone) e un mantello idrofilo di PEG (polietilenglicole) sono stati realizzati con vari rapporti molari. Il PCL è stato sintetizzato attraverso l’apertura dell’anello dell’ε-caprolattone (ROP). Successivamente, una polimerizzazione radicalica per trasferimento atomico (ATRP) è stata realizzata con il polietilenglicole metil etere metacrilato (PEGMA) usando sia un iniziatore lineare, sia uno a 4-braccia. In questo modo è stato possibile realizzare copolimeri con un ben definito peso molecolare e una bassa dispersione (PDI) lineari e ramificati; essi, una volta dispersi in acqua, formano micelle molto stabili e di dimensioni modificabili, compatibili inoltre con la dimensione dei podociti (la barriera di filtrazione più esterna del glomerulo renale), che sono il target ultimo di questi nanomateriali. Una libreria di questi co-polimeri con differenti rapporti molari e caratteristiche fisico-chimiche è stata realizzata. Infine, esperimenti di incapsulamento e rilascio sono stati condotti con un immunosoppressore (ciclosporina A), che è stata riportata essere efficace nel trattamento dei podociti danneggiati, per verificare efficienza di incapsulamento e cinetiche di rilascio nel tempo di questi nanomateriali. La terapia genica potrebbe essere potenzialmente utilizzata in ogni malattia genetica, dal momento che permette di riparare i vari disordini genetici. Un approccio particolarmente interessante, fra i vari possibili, è quello di silenziare uno specifico gene, come ad esempio quelli coinvolti nella progressione molecolare dei tumori. Fra i meccanismi studiati vi è l’utilizzo di RNA interferente breve (siRNA), che è una classe di molecole di RNA a doppio filamento, lunghe tra 19-21 nucleotidi in grado di svolgere numerosi ruoli biologici. Più precisamente, i siRNA sono coinvolti nel pathway della interferenza dell’RNA, che porta all'interferenza dell'espressione di specifici geni con sequenze nucleotidiche complementari, degradando l'mRNA dopo la trascrizione, in modo tale da non far avvenire la traduzione. Uno dei maggiori vantaggi del siRNA è la sua potenza; poche molecole sono sufficienti per avere forti risposte attraverso un processo catalitico. Comunque, i siRNA sono molecole cariche negativamente e non sono in grado di passare efficacemente le membrane biologiche, quindi hanno un limitato uptake; inoltre, mancano di stabilità biologica e hanno una emivita molto breve nel sangue a causa del rapido degrado da parte delle nucleasi. Per il passaggio alla fase clinica dei siRNA è necessario dunque sviluppare un appropriato carrier che li protegga dal degrado e che ne faciliti l’endocitosi da parte della cellula e il rilascio nel citosol. Nanoparticelle di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) sono state sintetizzate e ricoperte con un lipide cationico 1,2-dioleoile-3-trimetilammonio-propano (DOTAP) per trasportare efficacemente i siRNA nel citosol. I siRNA sono stati legati sulla superficie tramite interazioni elettrostatiche (complessazione) a dare complessi siRNA-polimeri (polyplexes). Per valutare l’efficienza di incapsulamento e di rilascio un fluoroforo (Rodamina B) è stato incapsulato nelle nanoparticelle polimeriche e studiato attraverso l’assorbanza UV. La nanoprecipitazione è stata utilizzata come tecnica principale di sintesi dei polimeri e per l’incapsulamento della Rodamina B; essa è stata studiata e perfezionata tramite selezione di solventi e concentrazioni di polimero e lipidi, oltre che di stabilizzanti. Le nanoparticelle prodotte con questa tecnica sono risultate essere particolarmente omogenee e stabili per lungo tempo in acqua anche a 37°C. I polyplexes sono stati poi testati attraverso gel elettroforesi e spettroscopia a fluorescenza per valutare l’effettiva complessazione e le variazioni nel tempo in HEPES. Infine, questi nanocarriers sono stati testati con saggi di citotossicità e di uptake per verificare la reale capacità di raggiungere il citosol e l’eventuale effetto tossico. Tutta questa parte è stata svolta presso il Laboratorio di Biochimica Generale e di Farmacia dell’università di Gent (Belgio) sotto la supervisione del Prof. Kevin Breakmans and Dr. Sangram Keshari Samal.