Caratterizzazione e valutazione dell'efficacia di cellule staminali mesenchimali caricate in idrogeli per il trattamento della lesione al midollo spinale

Spinal cord injury (SCI) is considered as one of the most critical traumatic events due to its devastating consequences (motor and sensory disabilities) to the patients that are dealing with it. Based on collected data by the World Health Organization (WHO), every year, around the world, there are 250 000 and 500 000 people that suffer a SCI. Most events occur in 18 and 35 years age group, and the three most common causes are car accidents, accidental falls and events related to violence. SCI from neuropathological point of view is characterized by a "primary injury" caused by the interruption of the ascending and descending pathways due to direct mechanical damage to the spinal cord, which can be caused by a strong compression, stretching or by a transection of its. Subsequently it develops in "secondary injury" due to neurodegenerative events that worsen the prognostic framework with consequent disability and paralysis of upper and/or lower limbs. Specifically, the SCI is a multifactorial disease with different neuropathological events involving different cellular entities (neurons, glia and peripheral cellular infiltrates) during the evolution of the damage. These responses determine tissue degeneration phenomena and create a hostile environment for regeneration. All this implies an increased discontinuity in nerve transmissions from the over-axial centers to the spinal cord, resulting in motor paralysis and sensory dysfunction. Currently there is no treatment that can completely repair a damaged spinal cord, and the only treatment approved until now is based on the use of corticosteroids (methylprednisolone) and immediate surgical approaches to immobilize and stabilize the spine, trying to reduce the amplitude of the secondary lesion. Among, until now, the various promising therapies, stem cells, and in particular human mesenchymal stem cells (hMSCs), could represent a new therapeutic strategy for the treatment of SCI. However, the administration of these cells by systemic and by the intra-parenchyma route have significant limitations, such as a limited number of cells that are able to reach the site of injury or the limited viability of the them in the site of damage. In this context, tissue engineering tends to be widely regarded as a major opportunity in regenerative medicine. Tissue engineering bases its principles on the study and the intelligent application of a combination of cells and materials capable of being able to replace missing parts or repair damaged tissue parts. In general, its main aim is to "build" a biologically active structure and compatible able to carry drugs and/or appropriate therapeutic cells. Specifically, biomaterials represent a new and promising approach to SCI also, as they can allocate stem cells preserving their functionality and acting as a reservoir for the release of neuroprotective factors in the site of damage. Among the biomaterials, hydrogels are considered good candidates as a support for cell therapy. Hydrogels are hydrophilic three-dimensional polymer matrices, able to absorb large amounts of water or biological fluids and therefore able to accommodate inside them cells. However, the commercially available polymers show the limits related to the attachment and the preservation of cell viability that needing engineering strategies to improve utilization. In this study, we have developed and characterized a new hydrogel based on agarose and Carbomer 974P and polyethylene glycol (PEG), which combines several strategies to increase vitality, attachment, the density of hMSCs maximizing the release of neuro protective-factors. Specifically, it was evaluated a hydrogel functionalization with the tripeptide RGD (AC-PEG-RGD, able to increase the interactions of hMSCs with the biopolymer) and subsequently in the same hydrogel was made biomimetic thanks to an extracellular matrix deposit inside it (AC-PEG-RGD + ECM). In addition, the loading technique of hMSCs has been optimized involving a freeze-drying that improve the recall of medium containing the cells. These latter can be distributed in the hydrogel minimizing the mechanical-stress. The hydrogel (AC-PEG-RGD + ECM), thanks to functionalization with RGD and native to the deposition of extracellular matrix, showed in vitro a significant improvement in term of vitality, attachment and cell density compared to the hydrogel without matrix (AC -PEG-RGD). It was also shown that the hydrogel used is able to preserve the stemness of hMSCs. Given the promising results obtained in in vitro characterization, we decided to continue with in vivo evaluation on a murine model of SCI where it was observed that the hydrogel is able to maintain the viability of the hMSCs for at least nine days. Noteworthy is also the significant motor recovery of SCI model animal treated with hMSCs loaded hydrogel up to 35 days after injury, suggesting that the engineering system we developed has potentially therapeutic benefits in vivo. To further investigate the mechanisms by which the hMSCs confer protection after spinal injury, we also performed an analysis with flow cytometry on ex vivo tissue recovered from animals previously treated with hMSCs loaded in the hydrogel, noting that the innate inflammatory response was modulated preparing the environment in terms of pro-regenerative who explain the motor recovery. In conclusion, the present work demonstrates that treatment with hMSCs loaded hydrogel AC-PEG-RGD + ECM represents a promising new strategy for the treatment of SCI raising hopes for the patients.

La lesione del midollo spinale (SCI, dall’inglese Spinal Cord Injury) è considerata come uno tra gli eventi traumatici più critici a causa delle sue conseguenze devastanti (inabilità motoria e sensoriale) a cui vanno incontro i pazienti. Sulla base dei dati raccolti dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ogni anno, in tutto il mondo, vi sono 250 000 e 500 000 persone che subiscono una SCI. La maggior parte degli eventi si verifica nella fascia di età compresa tra i 18 e i 35 anni, e le tre cause più comuni sono incidenti stradali, cadute accidentali ed eventi di violenza. La SCI è caratterizzata da punto di vista neuropatologico da una “lesione primaria” dovuta all'interruzione delle vie ascendenti e discendenti a causa del danno meccanico diretto al midollo, che può essere provocato da una forte compressione, stiramento o da una transezione dello stesso. Successivamente si sviluppa una “lesione secondaria” dovuta ad eventi neurodegenerativi che peggiorano il quadro prognostico con conseguente disabilità e paralisi degli arti superiori e/o inferiori. Nello specifico, la SCI è una patologia multifattoriale che implica diversi eventi neuropatologici coinvolgendo diverse entità cellulari (neuroni, glia ed infiltrati cellulari periferici) durante l’evoluzione del danno. Questi determinano successivi fenomeni di degenerazione tissutale e creano un ambiente ostile alla rigenerazione. Tutto questo comporta un’aumentata discontinuità nelle trasmissioni nervose dai centri sopra-assiali al midollo spinale, con conseguente paralisi motoria e disfunzione sensoriale. Attualmente non esistono trattamenti in grado di riparare completamente un midollo spinale lesionato e l’unico trattamento ad ora approvato prevede l’utilizzo di corticosteroidi (metiprednisolone) e approcci chirurgici immediati per immobilizzare e stabilizzare la colonna vertebrale, cercando di ridurre l’ampiezza della lesione secondaria. Tra le diverse promettenti terapie ad ora proposte, le cellule staminali, ed in particolare le cellule mesenchimali umane (hMSCs), potrebbero rappresentare una nuova strategia terapeutica per il trattamento della SCI. Tuttavia, le somministrazioni di queste cellule per via sistemica e per via intra-parenchima presentano dei limiti significativi, quali ad esempio un numero limitato di cellule che in grado di raggiunge il sito di lesione oppure la limitata vitalità delle cellule nel sito di danno. In questo contesto, l’ingegneria tessutale tende ad essere largamente considerata come un importante opportunità nella medicina rigenerativa. L’ingegneria dei tessuti fonda i suoi principi sullo studio e l’applicazione intelligente di una combinazione di cellule e materiali in grado di poter sostituire parti mancanti o riparare parti danneggiate di tessuti. In generale, si tratta di “costruire” una struttura biologicamente attiva e compatibile capace di allocare farmaci e/o cellule terapeutiche appropriate. Nello specifico, i biomateriali rappresentano un originale e promettente approccio anche per la SCI, in quanto in grado di allocare cellule staminali preservandone la loro funzionalità e fungendo da reservoir per il rilascio di fattori neuro-protettivi nel sito di danno. Tra i biomateriali, gli idrogeli sono considerati ottimi candidati come supporto per la terapia cellulare. La loro struttura è caratterizzata da matrici polimeriche tridimensionali idrofile in grado di assorbire grandi quantità di acqua o liquidi biologici, e quindi in grado di ospitare al loro interno cellule. Tuttavia, i polimeri commercialmente disponibili, mostrano dei limiti nell’attecchimento e nella preservazione della vitalità cellulare che necessitano di strategie ingegneristiche in grado di migliorarne l’utilizzo. In questo studio, abbiamo quindi sviluppato e caratterizzato un nuovo idrogelo a base di agarosio e Carbomer 974P e polietilen glicole (PEG) che combina diverse strategie in grado di aumentare la vitalità, l’attecchimento, la densità delle hMSCs massimizzando il rilascio di fattori neuro-protettivi. Specificamente, è stata valutata una funzionalizzazione con tripeptide RGD dell’idrogelo (AC-PEG-RGD, in grado di aumentare le interazioni delle hMSCs con il biopolimero) e successivamente lo stesso idrogelo è stato reso biomimetico mediante un deposito di matrice extracellulare al suo interno (AC-PEG-RGD+ECM). Inoltre è stata ottimizzata la tecnica di caricamento delle hMSCs che prevede una liofilizzazione ed un successivo richiamo di medium contente le cellule, quest’ultime in grado di distribuirsi nell’idrogelo riducendo al minimo lo stress meccanico. L’idrogelo (AC-PEG-RGD+ECM), grazie alla funzionalizzazione con RGD e alla deposizione di matrice extracellulare nativa, ha mostrato un significativo miglioramento in termini di vitalità, attecchimento e densità cellulare rispetto all’idrogelo senza matrice (AC-PEG-RGD) in vitro . Inoltre è stato dimostrato che l’idrogelo utilizzato è in grado di preservare la staminalità della hMSCs. Dati i promettenti risulti ottenuti dalla caratterizzazione in vitro, si è scelto di proseguire con le valutazioni in vivo su un modello murino di SCI dove è stato osservato che il gel riesce a mantenere vitali le hMSCs per almeno 9 giorni. Degno di nota è inoltre il significativo recupero motorio dell’animale con SCI trattato con hMSCs caricate in idrogelo fino a 35 giorni dopo la lesione suggerendo che il sistema ingegneristico da noi sviluppato risulta avere potenzialità terapeutiche anche in vivo. Per indagare ulteriormente il meccanismo con cui le hMSCs conferiscono protezione dopo lesione spinale, abbiamo inoltre eseguito un’analisi con citofluorimetria a flusso su tessuto ex-vivo recuperato da animali precedentemente trattati con hMSCs caricate in idrogelo, osservando che la risposta infiammatoria innata era stata modulata predisponendo l’ambiente in termini pro-rigenerativi il quale spiegherebbe il recupero motorio. In conclusione il presente lavoro di tesi dimostra che la terapia con hMSCs caricate in idrogelo AC-PEG-RGD+ECM rappresenta una nuova promettente strategia per il trattamento della SCI aumentando le speranze di recupero in pazienti mielolesi.