Development and validation of a bioengineered neurovascular unit on a microfluidic platform

INTRODUCTION Due to improved life expectancy, neurodegenerative disease, such as Alzheimer’s and Parkinson’s are becoming not only a clinical challenge but also a social burden. Pathogenesis of these disease is often unclear and current clinical treatments are limited to palliative care. Dysfunctions of the vasculature in the central nervous system (CNS) has been linked to onset of neurodegenerative disease but the underlying mechanisms remains mostly unknown. The neurovascular unit (NVU) comprises a complex microenvironment where neurons, glial, stromal and endothelial cells are the major cellular components. Endothelial cells supported by glial and stromal cells also constitute the blood brain barrier (BBB). The BBB structure regulates the homeostasis of the neurovascular unit, modulating the transport of molecules from the circulating blood to the central nervous system (CNS). Currently, simplified in vitro models, rely on a two-dimensional (2D) culture of endothelial cells alone or in co-culture with glial cells. The main limits of such existing models that rely mainly on transwell cultures are the inadequacy to mimic the tri-dimensional (3D) cellular arrangement found in in vivo conditions and the lack of sufficient biological complexity. In 2D models, in fact, cellular growth is restricted to a planar morphology, limiting important in vivo processes. Similarly, 2D existing models don’t contain the culture of neurons, which are crucial for a model developed to study neurodegenerative diseases. By contrast, bioengineered techniques, based on microfluidics, are now enabling the development of advanced in vitro models of the BBB and NVU. Micron-sized channels offer the possibility to better control media flow and reagent delivery to create a more physiological environment addressing some of the problems mentioned above. They also allow for more complex experimental designs (multicellular systems) while reducing costs at the same time. GOALS and PROCEDURE Our goal was to develop and validate a bioengineered human in vitro neurovascular unit model, motivated by the need to have a platform for neurodegenerative disease study and drug delivery testing. The first part of the work was the fabrication and use of the microfluidic device to model cell culture processes inside the device. We combined soft lithography techniques and biotechnologies in order to obtain a single layer polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic platform in which we seeded and cultured four cell types: human cerebral microvascular endothelial cells (hCMED/D3 cell line), human pericytes cell line, astrocytes and neurons both derived from human induced pluripotent stem cells. We choose to use four different cell types in order to create a biologically complex model and to design a platform in which was possible to study drug delivery across the endothelial barrier, neural response to drugs able to cross the barrier and neural development in relation to the microenvironment. We also introduced the use of human induced pluripotent stem cells to confirm their stability inside the microfluidic system, providing an important step towards the development of patient-specific models. The second part of the work consisted in the design of multiple validation and functional assays which we then used for the characterization of our NVU model. We assessed the morphology and expression of characteristic markers for all the cells inside the microfluidic device by immunocytochemistry and confocal imaging. Then, in order to assess the tightness of the endothelial barrier, we calculated the permeability coefficient evaluating the diffusion of a fluorescent dextran across the endothelial cell layer formed inside the microfluidic device. We also measured the trans endothelial electrical resistance (TEER) of the endothelial barrier inside the device. While TEER measurement is a well assessed technique for 2D cell culture platforms (transwells, commercially available wells), its evaluation in microfluidic devices is more complicated due to the difficulties of electrodes placement and measure uniformity as also previously mentioned in literature. Therefore, we combined a commercially available board with custom made electrodes suitable for our purpose. For neural cells, we evaluated their vitality inside the microfluidic platform by means of two different techniques: a live calcium imaging assay to visualize the calcium intake in the neural cells proving their functionality and a filament analysis, based on the immunocytochemistry images to assess the development of neurites. RESULTS and DISCUSSION The NVU model developed has proven to be stable up to one week of culture inside the microfluidic device and the immunocytochemistry analysis highlighted protein expression consistent with each cellular phenotypes. The permeability assay of the endothelial layer demonstrated the size-selectivity of the model. The permeability values resulted comparable with previous literature for in vitro models but are still far from values reported in vivo. The evolution of the trans endothelial electrical resistance measurement showed the progressive formation of the barrier even if the specific values are not comparable with a wide literature due to intrinsically different measurements approaches. Lastly, has been confirmed the importance of glial cells in the homeostasis of neurons and the maintenance of neural viability during in vitro culture inside the microfluidic device. In conclusion, our model introduces additional degrees of complexity in comparison with existing models thus allowing for more precise analysis of the interactions between the main cells forming the neurovascular unit. Advanced microfluidic models, along with in vivo studies could provide crucial insights on the role of the BBB and NVU in the pathogenesis and progression of neurodegenerative diseases, leading to better treatments for patients.

Introduzione A causa dell’invecchiamento della popolazione mondiale, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e Parkinson costituiscono non solo una grande sfida medica, ma anche un crescente problema sociale. La patogenesi di tali malattie é spesso non completamente compresa e le terapie sono limitate a cure di carattere palliativo. Recenti studi collegano disfunzioni della vascolatura del sistema nervoso centrale (SNC) con l’insorgenza di malattie neurodegenerative. L’unità neurovascolare (UNV) comprende un complesso microambiente in cui neuroni, cellule della glia, cellule stromali e cellule endoteliali costituiscono i componenti cellulari principali. Le cellule endoteliali supportate dalle cellule gliali e stromali costituiscono la barriera ematoencefalica (BEE). Questa struttura regola l’omeostasi dell’unità neurovascolare, modulando il trasporto di molecole dal flusso sanguigno al sistema nervoso centrale. Ad oggi, modelli semplificati in vitro, si basano sulla coltura bi-dimensionale (2D) di cellule endoteliali coltivate singolarmente o in co-cultura con cellule gliali. I principali limiti di questi modelli, basati su cultura in transwell, sono l’inadeguatezza nel replicare le condizioni di coltura tri-dimensionale (3D) in vivo e la carenza di complessità e rilevanza biologica. Nei modelli 2D infatti, la crescita cellulare è limitata ad una morfologia planare, impedendo importanti processi che si verificano in vivo. In maniera analoga, gli esistenti modelli 2D non includono la coltura di neuroni, che sono fondamentali per lo sviluppo di un modello che si possa usare per lo studio di malattie neurodegenerative. Diversamente, tecniche bio-ingegneristiche basate sulla microfluidica, permettono oggi lo sviluppo di modelli avanzati di UNV e BEE. I micro-canali offrono la possibilità di avere un ambiente più simile a quello fisiologico e di controllare con precisione il flusso di mezzo di coltura e la diffusione dei reagenti, risolvendo alcuni dei problemi sopra citati. Inoltre permettono lo svolgimento di esperimenti complessi (introducendo più tipi cellulari) mantenendo allo stesso tempo bassi i costi (limitati volumi di reagenti e mezzi di coltura). Obiettivi e procedura Il nostro obbiettivo era lo sviluppo e la validazione di un modello bio-ingegnerizzato di unità neurovascolare, motivati dalla necessità di avere una piattaforma per lo studio delle malattie neurodegenerative e della diffusione di farmaci nel sistema nervoso centrale. La prima parte del lavoro è stata la fabbricazione del dispositivo microfluidico unita alla coltura cellulare all’interno dello stesso. Abbiamo combinato tecniche litografiche e biotecnologiche con lo scopo di ottenere un dispositivo composto da un unico strato di polidimetilsilossano (PDMS) in cui abbiamo seminato e coltivato quattro tipi cellulari: cellule di linea umane endoteliali della microvascolatura cerebrale (hCMECD/3), periciti di linea umani, astrociti e neuroni, questi ultimi entrambi derivati da cellule umane a pluripotenza indotta. Abbiamo scelto di usare quattro tipi cellulari con lo scopo di creare un modello biologicamente complesso e di sviluppare quindi una piattaforma su cui fosse possibile studiare la diffusione di farmaci a cavallo della BEE, la risposta neuronale allo stimolo farmacologico e lo sviluppo neuronale in relazione al micro-ambiente. Inoltre abbiamo introdotto l’uso di cellule umane a pluripotenza indotta per confermarne la stabilita all’interno del nostro sistema microfluidico, segnando un importante passo verso lo sviluppo di modelli paziente-specifici. La seconda parte del lavoro è consistita nello sviluppo di molteplici esami di validazione che abbiamo successivamente usato per caratterizzare il nostro modello di UNV. Abbiamo analizzato la morfologia e l’espressione di markers caratteristici di ogni tipo cellulare usato all’interno del dispositivo microfluidico tramite immunofluorescenza. Successivamente, con lo scopo di valutare la compattezza della barriera endoteliale, ne abbiamo calcolato il coefficiente di permeabilità valutando la diffusione di molecole fluorescenti di destrano a cavallo dello strato endoteliale formato all’interno del dispositivo microfluidico. Inoltre, abbiamo misurato l’impedenza elettrica dello strato endoteliale (IEE) all’interno del dispositivo. Mentre le tecniche di misura della IEE sono ben convalidate per le colture2D (transwell, well commerciali per la misura di IEE), la sua valutazione in dispositivi microfluidici è più complicata a causa del posizionamento degli elettrodi e della non uniformità di misura. Abbiamo perciò combinato una scheda elettronica commerciale con un paio di elettrodi realizzati su misura per il nostro dispositivo. Per quanto riguarda le cellule neurali, ne abbiamo valutato la vitalità con due tecniche: abbiamo sviluppato e condotto un’analisi di influsso cellulare di ioni Ca2+ in tempo reale e abbiamo compiuto un’analisi, basata sulle immagini a immunofluorescenza, di confronto dello sviluppo di neuriti in diverse condizioni di coltura all’interno del dispositivo microfluidico. Risultati e conclusioni Il modello di unità neurovascolare sviluppato si è dimostrato stabile fino ad una settimana di coltura all’interno del dispositivo e l’analisi di immunofluorescenza ha evidenziato un’espressione proteica consistente con i fenotipi cellulari. L’esame di permeabilità dello strato endoteliale ha dimostrato la selettività dimensionale del modello ma ne ha anche evidenziato alcuni limiti come la variabilità tra gruppi uguali in esperimenti differenti. Il complesso processo di semina delle cellule endoteliali può essere una causa di tale variabilità dovuta alla differente entità di adesione cellulare iniziale ottenuta nei diversi esperimenti. Ciononostante, i valori di permeabilità calcolati sono in linea con la letteratura, sebbene ancora distanti dalle condizioni in vivo. L’evoluzione dell’impedenza elettrica dello strato endoteliale ha dimostratola formazione progressiva della barriera anche se i valori specifici non sono paragonabili con una letteratura ampia e risultano quindi poco significativi. Infine è stata confermata l’importanza della presenza di cellule gliali nell’omeostasi dei neuroni e nel mantenimento della loro vitalità durante la coltura in vitro all’interno del dispositivo microfluidico. In conclusione il nostro modello introduce nuovi gradi di complessità in relazione ai modelli esistenti permettendo quindi un’analisi più precisa delle interazioni tra le componenti cellulari più importanti dell’unità neurovascolare. Modelli microfluidici avanzati, insieme a studi in vivo, possono fornire delucidazioni critiche sul ruolo della barriera ematoencefalica nella patogenesi e progressione di malattie neurodegenerative, portando in ultima analisi a migliorie nelle terapie cliniche.