Progettazione e realizzazione di un bioreattore per la ricellularizzazione di matrici tendinee

The tendon is an anatomical structure located between muscles and bones with the aim to transmit the load from the muscles to the bones allowing movements. Thus, tendons are exposed to high strain levels. Since this structure is poorly vascularized and oxygenated, when injured, it presents a low grade of regeneration associated with a decrease in the life quality of the patient. In the last years, tendon diseases are going to increase due to the increasing age of the population as well as to the sport activity in elders. A sudden tendon rupture can be generated from a strong contraction that brings to an elongation of the tendon, leading to a laceration. Otherwise, a rupture can occur as a consequence of previous latent lesions that bring tendon structure to weaken until their final rupture. Conventional techniques to treat damaged tendons include the use of direct sutures or autografts, allografts and xenografts. These techniques have some important limits. The autologous grafts fail to meet the whole request because of the limited amount of the tendons. Tissue engineering offers an attractive alternative involving the development of biological or hybrid substitutes for the implantation in the body with the goal to address the remodeling and regeneration of the injured tissue. This thesis has the goal to project a bioreactor able to apply a cyclic strain load on decellularized tendon matrices to guarantee the production of a bioartificial construct with mechanical proprieties as close as possible to the native tendon tissue. The main properties and characteristics that have to be taken into account in designing a proper bioreactor for tendons are: • to have a minimal amount of space • to give a cyclic strain to multiple, parallel constructs • to be adaptable • to generate a biological, sterile chamber that contains the tissue and prevents any microbiological contamination • to generate an appropriate system for the tissue fixation • to generate a control system able to apply the mechanical load and to standardize the load parameters • To characterize and validate the bioreactor In a first, preliminary phase of design, we defined the elements of the bioreactor to comply with the design specifications. A CAD model was created for every single bioreactor component. The preliminary design was developed by dividing the bioreactor in two blocks: the mechanical one and the control one. The mechanical block consists in a control system that gave the necessary strength to stretch the samples and the culture chamber that allowed the housing of the constructs. The gripping system has a mechanical locking system with a triple function. In fact, in addition to maintain the tendon in the correct position, and to transfer the load forces from the actuation system to the tendon, it provides for the isolation of the culture chamber from the external environment thanks to the presence of an o-ring. This o-ring, in fact, when the gripping system is closed, allows a tight seal of the culture chamber. The control block was performed thanks to LabView. It allows to control the bioreactor, together with a National Instrument driver. The LabView program is made up of many subroutines to give more versatility and to obtain an easily handling bioreactor. A first subroutine allows a manual control of the motor. It gives the possibility to perform a single step in order to simplify the assembly of the culture chamber in the presence of tendons with different dimensions. A second subroutine allows, through a simple graphical interface, to perform a pre-load to stretch the tendon. This preloading value can be set by the user. In case of lack or rupture of the tendon, and/or a very high preload value, the software shows a feedback system to stop the program one time it will arrive at the end of the run. Lastly, the subroutine that allows the tendon stimulation gives the possibility to the user to decide the frequency and displacement values for the tendon stimulation, the stimulation/rest time and the number of daily cycles. The values range for the frequency can vary from 0 to 1Hz. A maximum deformation limit has not been set up. However, the meaximum value that allows the correct function of the bioreactor is evalutated after the preloading and displayed. During the stimulation, it is possible to evaluate a graph that shows in real time the applied force from the motor to deform the tendon and compare the elastic modulus of the tendon through a load cell placed along the control system. Others commands were implemented to analyze the data later and/or to save/load data. Given the close distance between the gripping and the culture medium inlet zone in the chamber, a fluid dynamics analysis (CFD, Computational Fluid Dynamics) was carried out by using computational analysis, in order to be able to analyze and evaluate the flow lines and the speed in the chamber in addition to the possible presence of whirling zones or turbulent flows. In a second phase, a prototype was developed to carry out testing and analyses with the aim to identify possible critical issues and problems not predictable in the design phase. The components of the control system and the culture chamber are made of AISI 316L or Delrin to ensure stiffness and biocompatibility. The supporting disc was made in Polylactic acid (PLA) through a 3D printer. Once assembled, the bioreactor was used to test the correct working of the software and to analyze the correct interaction between the program and the mechanical components. Rated the best performance, we analyzed the mechanical endurance and the hydraulic seal of the bioreactor using a decellularized tendon immersed in PBS for 7 days. The bioreactor was placed on a test bench and the tendon was stimulated for 7 days at a frequency of 0.33Hz and 3% deformation for 15/30/60 minutes with breaks of 15/30/60 minutes, respectively. This process is repeated every 12 hours. After 7 days, the tendon was removed from the grip and the presence of failures in the mechanical structure or signs of leakage of the medium were assessed. Then, the sterility of the bioreactor culture was evaluated. For this experiment, a specific broth for microorganisms was used the bioreactor was assembled under a laminar flow hood and placed in an incubator for 7 days recreating the experimental conditions. Then, 100 μl of broth were seeded onto a blood agar plate, non-selective growth medium which allows growth of the majority of microbial species, and incubated for 24 hours at 37°C and 5% CO2. In addition, 100 μL of growing medium were inoculated into BHI and incubated at 37°C for 15 days in order to assess bacterial growth in the enrichment medium. The sterility tests carried out on the culture system of the bioreactor confirmed the absence of any bacterial contamination.

Il tendine è una struttura anatomica interposta tra muscoli e ossa che ha il compito di trasmettere la forza dai primi ai secondi e, in questo modo, rendere possibile il movimento. Il tendine quindi è sottoposto a sforzi di trazione molto elevati. La sua scarsa vascolarizzazione e ossigenazione non permettono, in caso di lesioni, un buon grado di rigenerazione riducendo la qualità della vita del paziente. Negli ultimi anni le lesioni ai tendini stanno aumentando sempre di più a causa dell’aumento della vita media delle popolazioni e all’incremento delle attività sportive a livello amatoriale anche in età avanzata. La rottura improvvisa del tendine può essere generata da una violenta contrazione del muscolo che porta il tendine ad un allungamento tale da causare la lacerazione, oppure può instaurarsi su precedenti lesioni che determinano un indebolimento del tendine causando uno stress continuo fino a rottura. Tecniche convenzionali per il trattamento di tendini lesionati comprendono approcci chirurgici mediante suture dirette del tessuto o l’uso di autograft, allograft e xenograft. Queste tecniche però hanno importanti limitazioni. L’ingegneria dei tessuti offre un attrattiva alternativa coinvolgendo lo sviluppo di sostituti biologici o ibridi per l’impianto nel corpo con lo scopo di indirizzare verso il rimodellamento e la rigenerazione di un tessuto danneggiato. Questo lavoro di tesi si colloca in questo ambito, avendo come scopo la progettazione di un bioreattore capace di applicare una stimolazione a trazione ciclica su un tendine decellularizzato con lo scopo di garantire la produzione di un costrutto bioartificiale con le proprietà meccaniche più vicini possibili al tessuto tendineo nativo. Le specifiche di cui si è tenuto conto nella fase di progettazione sono state: • consentire una stimolazione meccanica a trazione ciclica • avere un ingombro ridotto • permettere la stimolazione di più costrutti in parallelo • essere versatile • realizzare una camera biologica sterile che contenga il tessuto e prevenga le contaminazioni microbiche • realizzare un’appropriata struttura di afferraggio per il costrutto • realizzare un sistema di controllo per applicare carichi meccanici e standardizzare i parametri di carico • caratterizzare e validare il bioreattore realizzato In una prima fase preliminare di progettazione, partendo dalle specifiche di progetto si sono definiti gli elementi del bioreattore per rispettare le specifiche di progetto. Definiti gli elementi, si è passato alla realizzazione in CAD di ogni singolo elemento del bioreattore. La progettazione preliminare è stata sviluppata dividendo il bioreattore in due blocchi: il blocco meccanico ed il blocco di controllo. Il blocco meccanico è composto dal sistema di attuazione, che genera la forza necessaria a stirare i campioni, la camera di coltura che ha il compito di permettere l’alloggiamento dei costrutti cellulari. Il sistema di afferraggio realizzato ha un sistema di chiusura meccanico ed è stato pensato per avere una triplice funzione. Infatti, oltre ad avere la funzione di tenere in sede il tendine e di trasferire gli sforzi di carico dal sistema di attuazione al tendine esso provvede all’isolamento della camera di coltura dall’ambiente esterno grazie alla presenza di un oring posto al suo interno. Tale oring, infatti, chiuso il sistema di afferraggio permette una tenuta stagna della cameretta di coltura. Il blocco di controllo è realizzato tramite LabView. Esso permette, insieme ad una scheda National Instrument di controllare il bioreattore. Il programma Labview è composto da vari sottoprogrammi per permettere la maggior versatilità e semplicità di utilizzo del bioreattore. Un primo sottoprogramma permette il controllo manuale del motore che permette di effettuare singoli passi per semplificare la parte di montaggio della camera di coltura in presenza di tendini con dimensioni differenti fra loro. Un secondo sottoprogramma permette, per mezzo di una semplice interfaccia grafica, di effettuare un precarico per mettere in tensione il tendine. Tale valore di precarico può essere impostato dall’utente. In caso di distacco del tendine o inserimento di un valore di precarico troppo elevato, il software presenta un sistema di feedback per fermare il programma una volta arrivato a finecorsa. Infine, il sottoprogramma che consente la vera e propria stimolazione del tendine permette di variare i valori di frequenza e deformazione di stimolazione del tendine, il tempo di stimolazione/pausa e il numero di cicli giornalieri da effettuare. Il range di valori di frequenza impostati possono variare da 0 a 1Hz. Per la deformazione non è stato impostato un valore massimo ma è presente un indicatore che mostra il valore massimo di deformazione massimo consentito in base all’entità del precarico effettuato in precedenza. Durante la stimolazione è possibile vedere l’andamento della forza applicata dal motore per deformare il tendine e valutare il modulo elastico del tendine grazie ad una cella di carico posta lungo il sistema di attuazione. Altri comandi sono stati implementati per poter analizzare i dati e in fasi successive e/o salvare/caricare dati. Date le distanze ravvicinate tra l’afferraggio e la zona d’ingresso del mezzo di coltura nella camera, si è proceduto, mediante analisi computazionali, ad un’analisi fluidodinamica (CFD, Computational Fluid Dynamics) al fine di poter analizzare e valutare le linee di flusso e le velocità in gioco oltre alla possibile presenza di zone vorticose o di flussi turbolenti. In una seconda fase si è realizzato un prototipo per poter effettuare test ed analisi con lo scopo di individuare possibili criticità e problemi non previsti in fase di progettazione. I componenti del sistema di attuazione e della camera di coltura sono stati realizzati in AISI 316L o Delrin per garantire rigidezza e biocompatibilità. Il disco di supporto è stato realizzato tramite stampa 3D in acido Polilattico (PLA). Montato il bioreattore è stato effettuato inizialmente un test sul corretto funzionamento del software per analizzare la corretta interazione tra il programma e le componenti meccaniche. Valutato il corretto funzionamento, si è passati ad analizzare il funzionamento meccanico e la tenuta idraulica del bioreattore utilizzando un tendine equino decellularizzato. Il bioreattore è stato posto su un banco di prova e il tendine è stato stimolato per 7 giorni ad una frequenza di 0.33Hz e 3% di deformazione per 15/30/60 minuti con pause rispettivamente da 15/30/60 minuti. Questo processo è ripetuto ogni 12 ore. Al termine del settimo giorno il tendine è stato tolto dalla morsa e si è valutata la presenza di cedimenti nella struttura meccanica o segni di perdite di medium. Valutata quindi la piena funzionalità e affidabilità in termini software e meccanici si è passati ad un analisi sul mantenimento della sterilità del bioreattore in coltura. Per tale esperimento è stato utilizzato un terreno di arricchimento utilizzato per la coltura di un'ampia varietà di microrganismi, facilitando la crescita di batteri. Il bioreattore è stato montato sotto cappa biologica e posizionato in incubatore per 7 giorni ricreando le condizioni sperimentali. Al settimo giorno è stato prelevato il terreno di coltura dalla camera sterilmente. 100 µl di brodo sono stati seminati su una piastra agar sangue, terreno di coltura non selettivo che consente la crescita della maggior parte delle specie microbiche, e incubato per 24 ore a 37°C e 5 % di CO2. Inoltre, 100 µl di brodo sono stati inoculati in BHI e incubati a 37°C per 15 giorni al fine di valutare la crescita batterica in terreno di arricchimento. Il test di sterilità effettuato sul sistema di coltura del bioreattore ha confermato l’assenza di ogni forma contaminazione batterica.