Development of methodologies for an accurate and efficient estimation of the interaction free energy in protein-protein and protein-ligand systems

In this thesis three different systems have been investigated with the aim of evaluating the binding free energy. For each system methods available in literature have been used to efficiently and accurately study the interaction. The first system is a protein-ligand interaction, formed by a Fab fragment of immunoglobulin and a protein commercially used in the affinity chromatography step of the purification of monoclonal antibodies. In this work the complexes between one domain of protein L and Fab fragments have been investigated using molecular dynamics simulations to evaluate the contributions to the binding affinity of the residues of both protein L and Fab fragments. The effect of a small number of single point mutations to histidine and their protonation state on the affinity has been investigated to find mutations of the affinity ligand that could allow the use of milder conditions during the elution process of an affinity chromatography purification cycle, since the low pH used to recover the product, between 2 and about 3.5, can induce aggregation and conformational changes in the antibodies. The second case study is the interaction between two charged proteins, Lysozyme and Chymotrypsinogen A, and a charged surface. Here two methodologies for the estimation of the binding free energy of interaction with different levels of accuracy and different computational costs, have been combined. The result is a protocol that allows a fast and accurate estimation of the binding free energy between the proteins and the surface. The systems investigated are models of a IEX chromatography phase for the purification of the two proteins of interest. Calculated values have been used to estimate the retention factor of the chromatography process in order to compare the theoretical results with the experimental values. The last system investigated is the formation of aggregates between two polyglutamine chains. These peculiar polypeptides are cause of a number of neurodegenerative diseases, like Huntington’s disease, Kennedy’s disease, dentatorubral-pallidoluysian atrophy, and many forms of spinocerebellar ataxia. The mechanism by which polyglutamine chains lead to the symptoms typical of these diseases is not yet fully understood. It is known that pathological polyQ chains form aggregates containing β-sheets structure in a amyloid-like fashion, but their structure is still not know, due to the difficulty of obtaining high resolution data of the aggregates. In this work we propose a model of the formation of aggregates, using an enhanced sampling technique, that allows to gain insight in a possible mechanism of formation of the aggregate, and offer the possibility of estimating the binding free energy for the formation of the complex.

In questo lavoro di tesi tre diversi sistemi sono stati investigate con lo scopo di stimare l’energia libera di legame. Per ogni sistema, metodi disponibili in letteratura sono stati utilizzati per ottenere una stima efficiente ed accurata dell’energia di interazione. Il primo sistema è un complesso proteina-ligando, formato da un frammento Fab di un’immunoglobulina e una proteina commercialmente utilizzata nella fase di purificazione degli anticorpi monoclonali con cromatografia d’affinità. In questo lavoro i complessi tra un dominio della proteina L e i frammenti Fab sono stati studiati investigati usando simulazioni di dinamica molecolare per valutare il contributo all’affinità di legame dei residui della proteina L e dei frammenti Fab. L’effetto di un piccolo numero di mutazioni a istidina e del loro stato di protonazione sull’affinità è stato investigato per individuare mutazioni del ligando cha possano permettere l’uso di condizioni di eluzioni meno aspre durante la purificazione, in quanto il pH basso, tra 2 e 3.5, utilizzato può indurre aggregazione e cambi conformazionali negli anticorpi. Il secondo caso studio è l’interazione tra due proteine cariche, Lisozima e Chimitripsinogeno A, e una superficie carica. Qui, due metodologie per la stima delle energie libere di interazione con diversi libelli di accuratezza e costo computazionale sono stati combinati. Il risultato è un protocollo che permette una stima rapida e accurata dell’energia di legame tra le proteine e la superficie. I sistemi investigati sono modelli di una fase di purificazione per cromatografia a scambio ionico delle due proteine di interesse. I valori calcolati sono stati poi utilizzati per stimare i fattori di ritenzione del processo cromatografico per avere un confronto tra i risultati teorici e i valori sperimentali. L’ultimo sistema investigato è la formazione di aggregati tra due catene di poliglutammine. Questi particolari polipeptidi sono causa di malattie neurodegenerative, come la malattia di Huntington, e molte forme di atassia spinocerebellare. Il meccanismo per cui le catene di poliglutammine portano ai sintomi tipici di queste malattie non è ancora stato compreso a pieno. È noto che catene di polyQ con una lunghezza patologica formano aggregati contenenti strutture a beta foglietto simili alle fibrille amiloidi, ma la loro esatta struttura non è ancora nota, a causa della difficoltà di ottenere dati ad alta risoluzione degli aggregati. In questo lavoro proponiamo un modello per la formazione degli aggregati, usando un metodo di enhanced sampling, che permette di ottenere informazioni su un possibile meccanismo di formazione degli aggregati, e che offre la possibilità di stimare l’energia libera di formazione del complesso.