The emerging field of mechanobiology aims at investigating how cells sense and respond to extracellular or intracellular mechanical signals, highlighting the biophysical mechanisms which connect mechanical stimuli and fundamental cell functions. In this context, methods for the application of controller and localized forces to single cells are required to properly mimic the behavior of the extracellular microenvironment. However, current techniques for mechanobiology studies still have several limitations, not properly allowing to apply localized, inhomogeneous and prolonged forces. This thesis work deals with the development of two innovative micromagnetic devices for studies in mechanobiology. The first tool, based on magnetic domain wall tweezers (DWTs), is suitable for the application of finely controlled and localized forces on target cells. Domain walls propagating in microfabricated ferromagnetic rings, acting as movable attracting poles, are exploited to trap and handle superparamagnetic beads in a cell culture environment. The device is tested with 1 μm particles which are manipulated against the membrane of HeLa cells cultured on-chip, thus exerting highly localized forces. Local deformations of the cell membrane are observed and measured via confocal microscopy. Forces producing cell indentations are in the order of hundreds of pN, in good agreement with the prediction of an elastic model of the cell membrane. Noteworthy, an accurate quantification of forces is carried out via micromagnetic simulations, monitoring the particle position with respect to the attracting poles, which acts as a calibrated spring". In addition, it is shown that this technique allows for the manipulation of magnetic nanoparticles microinjected inside the HeLa cell cytoplasm, paving the way to the application of mechanical stimuli to the nucleus and cellular subcompartments. To summarize, this work demonstrates that DWTs represents a versatile and non-invasive on-chip technology for mechanobiology studies on single cells, where the application of localized forces is required. Crucial for applications in biology, it is fully compatible with real-time optical monitoring of the cell activity upon quantitative and localized mechanical stimulation. The second device developed in this thesis, is based on Fe-coated PDMS micropillars, which exert a periodic mechanical pinching on different points of the cell membrane, with a highly controllable intensity and time evolution. The application of uniform magnetic fields allows for the platform actuation, producing a controlled bending of the pillars and thus exposing the cells to mechanical stimuli. Due to the peculiar geometry of groups of magnetic pillars, when a rotating magnetic field is applied, each cell experiments a localized and biaxial periodic pinching. The time behavior of such stimuli is controlled by the field rotation, allowing for a tunable pinching frequency. The applied forces, evaluated by micromagnetic simulations, are in the order of tens of nN and can be finely modulated by tuning the external field. To assess the potential of this technique, it has been applied to the study of the mechanical and dynamic response of the cellular nucleus to the local pinching. In particular, it has been demonstrated how the application of forces on the cell at a pinching frequency of 0.1 Hz affects the nuclear morphology, deformability and H2B core histone turnover on chromatin. The extrapolation of the typical nuclear response time to the mechanical stimuli shows that, at the selected pinching frequency, nucleus-pillars coupling is not purely elastic but mediated by active cellular mechanisms. Indeed, an enhancement in actin dynamics during stimulation is observed, demonstrating that it plays a role in pillars-induced force transmission. Finally, translocation of MKL transcription cofactor from the nucleus to the cytoplasm is observed during stimulation, suggesting that local pinching affects genomic functions.

La meccanobiologia è un emergente campo di ricerca scientifica che si propone di indagare la risposta cellulare a stimoli meccanici, mettendo in luce i meccanismi bio-fisici indotti dall'applicazione di forze e il loro effetto sulle funzioni cellulari fondamentali. In questo contesto, vi è una crescente necessità di tecniche innovative che permettano l'applicazione di forze finemente controllate su singole cellule, così da riprodurre gli stimoli meccanici esercitati dalla matrice extracellulare. Tuttavia, le tecnologie attualmente disponibili per studi di meccano biologia, presentano diverse limitazioni non permettendo di esercitare sulle cellule forze localizzate, non-omogenee e prolungate. Questo lavoro di tesi tratta dello sviluppo di due dispositivi micromagnetici per studi nel campo della meccanobiologia che permettano di superare le limitazioni sopracitate. Il primo dispositivo, basato su una tecnologia chiamata "magnetic domain wall tweezers" (DWT), permette di applicare sulle cellule bersaglio stimoli meccanici finemente controllabili e spazialmente localizzati. Questa tecnica sfrutta la propagazione di pareti di dominio magnetiche in condotti ferromagnetici micro-fabbricati, aventi forma ad anello. Tali pareti di dominio agiscono come poli attrattori mobili che permettono di attrarre e manipolare particelle superparamagnetiche in un ambiente di coltura cellulare. Il dispositivo è stato testato con particelle aventi un diametro di 1 μm, le quali sono state manipolate fino ad entrare in contatto con la membrana di cellule HeLa coltivate su un chip, su cui esercitano forze altamente localizzate. Gli stimoli meccanici inducono deformazioni locali della membrana cellulare che sono state osservate e misurate tramite microscopia confocale. Le forze esercitate sulla membrana cellulare sono dell’ordine di centinaia di pN, in ottimo accordo con quelle previste da un modello elastico della membrana cellulare. In aggiunta, un’ accurata quantificazione delle forze esercitate è stata ottenuta attraverso simulazioni micro magnetiche, monitorando la posizione della particella rispetto ai poli attrattori (le pareti di dominio magnetiche) che agiscono come una “molla calibrata”. Inoltre, è stato mostrato come questa tecnologia permetta di manipolare nanoparticelle magnetiche microiniettate all’interno del citoplasma di cellule HeLa, offrendo la possibilità di applicare stimoli meccanici su compartimenti sub-cellulari e sul nucleo. In sintesi, questo lavoro dimostra le potenzialità della tecnica DWT: una tecnologia “on-chip” versatile e non invasiva per studi di meccanobiologia che richiedono l’applicazione di forze localizzate spazialmente. Il secondo dispositivo sviluppato in questa tesi consiste in micropilastri di PDMS ricoperti di Fe, che inducono un “pizzicamento” meccanico in diversi punti della membrana cellulare. Questa tecnica permette un elevato controllo sull’intensità e sulla dinamica temporale delle forze esercitate. L’applicazione di campi magnetici uniformi permette di attuare la piattaforma inducendo la flessione dei micropilastri, così da esporre le cellule a stimoli meccanici. A causa della peculiare geometria dei micropilastri magnetici, disposti in gruppi, su ciascuna cellula viene esercitato un “pizzicamento” periodico e biassiale, in presenza di un campo magnetico rotante. La dinamica temporale di tali stimoli è controllata dalla rotazione del campo magnetico, permettendo di regolare la frequenza di “pizzicamento”. Le forze esercitate da tale tecnica, quantificate tramite simulazioni micromagnetiche, sono nell’ordine di decine di nN e possono essere controllate in intensità modulando il campo magnetico esterno. Per dimostrare la potenzialità di questo dispositivo, esso è stato utilizzato per lo studio della risposta meccanica e dinamica del nucleo cellulare al “pizzicamento” indotto dai micropilastri. Nello specifico, è stato dimostrato come l’applicazione di forze sulla membrana cellulare, alla frequenza di “pizzicamento” di 0.1 Hz, altera la morfologia e la deformabilità del nucleo, oltre ad influenzare il “turnover” dell’istone H2B sulla cromatina. La misura del tempo caratteristico di risposta nucleare agli stimoli meccanici mostra che, alla frequenza di “pizzicamento”, l’accoppiamento micropilastri-nucleo non è puramente elastico, ma mediato da processi cellulari attivi. A tal proposito, è stato rilevato un incremento delle dinamiche dell’actina durante la stimolazione meccanica, dimostrando che il citoscheletro cellulare gioca un ruolo determinante nella trasmissione degli stimoli meccanici verso il nucleo. Infine, è stata rilevata la “traslocazione” del cofattore di trascrizione MKL dal nucleo cellulare verso il citoplasma, indicando che il “pizzicamento” generato dai micropilastri influenza le funzioni geniche.

Micromagnetic devices for single cell mechanobiology

MONTICELLI, MARCO

Abstract

The emerging field of mechanobiology aims at investigating how cells sense and respond to extracellular or intracellular mechanical signals, highlighting the biophysical mechanisms which connect mechanical stimuli and fundamental cell functions. In this context, methods for the application of controller and localized forces to single cells are required to properly mimic the behavior of the extracellular microenvironment. However, current techniques for mechanobiology studies still have several limitations, not properly allowing to apply localized, inhomogeneous and prolonged forces. This thesis work deals with the development of two innovative micromagnetic devices for studies in mechanobiology. The first tool, based on magnetic domain wall tweezers (DWTs), is suitable for the application of finely controlled and localized forces on target cells. Domain walls propagating in microfabricated ferromagnetic rings, acting as movable attracting poles, are exploited to trap and handle superparamagnetic beads in a cell culture environment. The device is tested with 1 μm particles which are manipulated against the membrane of HeLa cells cultured on-chip, thus exerting highly localized forces. Local deformations of the cell membrane are observed and measured via confocal microscopy. Forces producing cell indentations are in the order of hundreds of pN, in good agreement with the prediction of an elastic model of the cell membrane. Noteworthy, an accurate quantification of forces is carried out via micromagnetic simulations, monitoring the particle position with respect to the attracting poles, which acts as a calibrated spring". In addition, it is shown that this technique allows for the manipulation of magnetic nanoparticles microinjected inside the HeLa cell cytoplasm, paving the way to the application of mechanical stimuli to the nucleus and cellular subcompartments. To summarize, this work demonstrates that DWTs represents a versatile and non-invasive on-chip technology for mechanobiology studies on single cells, where the application of localized forces is required. Crucial for applications in biology, it is fully compatible with real-time optical monitoring of the cell activity upon quantitative and localized mechanical stimulation. The second device developed in this thesis, is based on Fe-coated PDMS micropillars, which exert a periodic mechanical pinching on different points of the cell membrane, with a highly controllable intensity and time evolution. The application of uniform magnetic fields allows for the platform actuation, producing a controlled bending of the pillars and thus exposing the cells to mechanical stimuli. Due to the peculiar geometry of groups of magnetic pillars, when a rotating magnetic field is applied, each cell experiments a localized and biaxial periodic pinching. The time behavior of such stimuli is controlled by the field rotation, allowing for a tunable pinching frequency. The applied forces, evaluated by micromagnetic simulations, are in the order of tens of nN and can be finely modulated by tuning the external field. To assess the potential of this technique, it has been applied to the study of the mechanical and dynamic response of the cellular nucleus to the local pinching. In particular, it has been demonstrated how the application of forces on the cell at a pinching frequency of 0.1 Hz affects the nuclear morphology, deformability and H2B core histone turnover on chromatin. The extrapolation of the typical nuclear response time to the mechanical stimuli shows that, at the selected pinching frequency, nucleus-pillars coupling is not purely elastic but mediated by active cellular mechanisms. Indeed, an enhancement in actin dynamics during stimulation is observed, demonstrating that it plays a role in pillars-induced force transmission. Finally, translocation of MKL transcription cofactor from the nucleus to the cytoplasm is observed during stimulation, suggesting that local pinching affects genomic functions.
TARONI, PAOLA
GHIRINGHELLI, GIACOMO CLAUDIO
7-lug-2017
La meccanobiologia è un emergente campo di ricerca scientifica che si propone di indagare la risposta cellulare a stimoli meccanici, mettendo in luce i meccanismi bio-fisici indotti dall'applicazione di forze e il loro effetto sulle funzioni cellulari fondamentali. In questo contesto, vi è una crescente necessità di tecniche innovative che permettano l'applicazione di forze finemente controllate su singole cellule, così da riprodurre gli stimoli meccanici esercitati dalla matrice extracellulare. Tuttavia, le tecnologie attualmente disponibili per studi di meccano biologia, presentano diverse limitazioni non permettendo di esercitare sulle cellule forze localizzate, non-omogenee e prolungate. Questo lavoro di tesi tratta dello sviluppo di due dispositivi micromagnetici per studi nel campo della meccanobiologia che permettano di superare le limitazioni sopracitate. Il primo dispositivo, basato su una tecnologia chiamata "magnetic domain wall tweezers" (DWT), permette di applicare sulle cellule bersaglio stimoli meccanici finemente controllabili e spazialmente localizzati. Questa tecnica sfrutta la propagazione di pareti di dominio magnetiche in condotti ferromagnetici micro-fabbricati, aventi forma ad anello. Tali pareti di dominio agiscono come poli attrattori mobili che permettono di attrarre e manipolare particelle superparamagnetiche in un ambiente di coltura cellulare. Il dispositivo è stato testato con particelle aventi un diametro di 1 μm, le quali sono state manipolate fino ad entrare in contatto con la membrana di cellule HeLa coltivate su un chip, su cui esercitano forze altamente localizzate. Gli stimoli meccanici inducono deformazioni locali della membrana cellulare che sono state osservate e misurate tramite microscopia confocale. Le forze esercitate sulla membrana cellulare sono dell’ordine di centinaia di pN, in ottimo accordo con quelle previste da un modello elastico della membrana cellulare. In aggiunta, un’ accurata quantificazione delle forze esercitate è stata ottenuta attraverso simulazioni micro magnetiche, monitorando la posizione della particella rispetto ai poli attrattori (le pareti di dominio magnetiche) che agiscono come una “molla calibrata”. Inoltre, è stato mostrato come questa tecnologia permetta di manipolare nanoparticelle magnetiche microiniettate all’interno del citoplasma di cellule HeLa, offrendo la possibilità di applicare stimoli meccanici su compartimenti sub-cellulari e sul nucleo. In sintesi, questo lavoro dimostra le potenzialità della tecnica DWT: una tecnologia “on-chip” versatile e non invasiva per studi di meccanobiologia che richiedono l’applicazione di forze localizzate spazialmente. Il secondo dispositivo sviluppato in questa tesi consiste in micropilastri di PDMS ricoperti di Fe, che inducono un “pizzicamento” meccanico in diversi punti della membrana cellulare. Questa tecnica permette un elevato controllo sull’intensità e sulla dinamica temporale delle forze esercitate. L’applicazione di campi magnetici uniformi permette di attuare la piattaforma inducendo la flessione dei micropilastri, così da esporre le cellule a stimoli meccanici. A causa della peculiare geometria dei micropilastri magnetici, disposti in gruppi, su ciascuna cellula viene esercitato un “pizzicamento” periodico e biassiale, in presenza di un campo magnetico rotante. La dinamica temporale di tali stimoli è controllata dalla rotazione del campo magnetico, permettendo di regolare la frequenza di “pizzicamento”. Le forze esercitate da tale tecnica, quantificate tramite simulazioni micromagnetiche, sono nell’ordine di decine di nN e possono essere controllate in intensità modulando il campo magnetico esterno. Per dimostrare la potenzialità di questo dispositivo, esso è stato utilizzato per lo studio della risposta meccanica e dinamica del nucleo cellulare al “pizzicamento” indotto dai micropilastri. Nello specifico, è stato dimostrato come l’applicazione di forze sulla membrana cellulare, alla frequenza di “pizzicamento” di 0.1 Hz, altera la morfologia e la deformabilità del nucleo, oltre ad influenzare il “turnover” dell’istone H2B sulla cromatina. La misura del tempo caratteristico di risposta nucleare agli stimoli meccanici mostra che, alla frequenza di “pizzicamento”, l’accoppiamento micropilastri-nucleo non è puramente elastico, ma mediato da processi cellulari attivi. A tal proposito, è stato rilevato un incremento delle dinamiche dell’actina durante la stimolazione meccanica, dimostrando che il citoscheletro cellulare gioca un ruolo determinante nella trasmissione degli stimoli meccanici verso il nucleo. Infine, è stata rilevata la “traslocazione” del cofattore di trascrizione MKL dal nucleo cellulare verso il citoplasma, indicando che il “pizzicamento” generato dai micropilastri influenza le funzioni geniche.
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