Synthesis of titanium dioxide nanotubes coated with soy isoflavones extracts to improve osseointegration

Titanium and its alloys are one of the most used biomaterials as hard tissues substitutes, thanks to their features as high biocompatibility, mechanical properties and corrosion resistance. The clinical success of dental or orthopaedic implants is related to their early osseointegration. After the implantation, there are two possible responses that may occur in host tissue: an acute inflammatory process that caused the formation of a fibrous tissue capsule which cause early implant failure, or living and functional bone tissue formation. For this reason, several surface modification treatments have been developed to allow the formation of a micro-rough surface that could enhance implant osseontegration. One example of these processes is the anodization treatment: an electrolytic passivation treatment used to improve thickness of the metal oxide layer, which improves bone implant integration. Particularly, using a fluoride-containing solution, the anodization treatment allows the production of a self-ordered nanotubular structure. The nanotubular structure homogeneity and dimensions could be easily modulated by varying several process parameters. Because titania nanotubes (TiO2 NTs) could enhance biocompatibility and cells activity and this behaviour is in dependence of diameter size, they could be used as coating for titanium implants. Moreover, nanotubes could be loaded with active biomolecules and used as controlled-local drug delivery system, whose trend depends on the nanotubular structure dimensions. One of the candidates as bioactive molecule that could be loaded on this nano-rough surface is a family of soybean-based biomaterials, whose properties have been compared to the ones of other natural biomaterials and revealed the possibility to use them as coatings for tissue regeneration. The promising features of these soy extracts are due to the presence of isoflavones: a family of molecules with a proved positive effect on bone metabolism. Particularly they contain genistein, that enhances bone matrix production and inhibits cell proliferation, and its glycosilated non-active form genistin. Moreover, genistein could improve osseointegration inhibiting osteoclasts activation. The aim of this projects was to produce a nanotubular structure that could enhance cellular adhesion and be also used to control the release of bioactive molecules that could further increase osteointegration. Particularly, the point was to define the parameters set that lead to the production of an homogeneous, strong and stable layer of nanotubes, around ten microns thick, with regular diameters, capable to uptake and release a drug. This structure should also have tunable diameters sizes, by varying the applied voltage, to allow the evaluation of how the release of soy isoflavones and osteoblastic cells activity are affected by nanotubes dimensions. Samples with the three different roughnesses were treated in two kind of electrolytes (an aqueous-based one and an organic one) and applying different voltages and times to define how the anodization set-up variables affect the nanotubes geometry and regularity. The nanotubular surface hydrophilicity was evaluated through a wettability test. Subsequently, chosen structures with dimensionally different nanotubes were loaded by deep-coating in a solution containing the soy isoflavones. The release trend of genistein and genistin was evaluated in dependence of nanotubes geometry through a spectrophotometric analysis. Then, samples were biologically characterized: the effect of both nanotubes and isoflavones on Saos-2 cell line morphology and proliferation was evaluated through phalloidin stainings and SEM analysis. The anodization experiments performed in the aqueous solution showed that a potentiostatic approach is necessary to modulate nanotubes diameter dimensions by varying the applied voltage. Moreover, treating samples in the ethylen-glycole electrolyte allowed the formation of a more regular structure of nanotubes with smooth walls and bigger lengths. Based on literature, in this kind of electrolyte an overlying irregular and disordered layer, called ''nanograss'', is obtained and its presence could depend on the initial surface roughness of samples. Then, was observed that this disordered layer is more or less compact in dependence of the anodization time. Samples from each kind of sheet were then anodized at 60 V for 6 hours and emerged that the presence of the nanograss layer decrease with an initial better surface quality. Specifically, sample with the lowest Ra resulted totally free from the superficial residuals, but the obtained dioxide layer showed a very low adherence to the underlying titanium surface and so samples 2 were chosen for the following experiments. Then attempts have been made to find a way to remove the nanograss layer after the anodization process. Was proved that a post-treatment in ultrasound for 20 seconds could totally remove the nanograss layer on samples. Furthermore this method resulted effective just if the anodization duration is longer than 2 hours and the applied potential is higher than 50 V. Concerning nanotubes dimensions, their lengths are bigger with a longer anodization treatment and with an higher applied voltage which also increases diameter size. Once that the correlation between nanotubes geometry and process parameters was observed, two dimensionally different nanotubular structures were produced. Wettability test performed on those surfaces revealed that their hydrophilicity increases in presence of bigger nanotubes. Considering the drug release, in line with other autors works, the trend of genistein and genistin presents an initial high release and then another low release after around 24 hours. The molecules loaded quantity is really bigger on anodized samples and, particularly, this quantity increases on sample with bigger nanotubes. For what concerns cell morphology and adhesion, was observed that osteoblasts cultured on nanotubes and coated samples for more than 48 hours showed a uniform distribution on all the available area on each kind of substrate. Moreover, Saos-2 appeared flattened, polygonal shaped and interact between each others, especially on the smaller nanotubes. Moreover, cells proliferation increases in presence of titania nanotubes, while it decrease on samples coated with soy isoflavones extracts. Considering samples coated with soy isoflavones extracts, especially the one anodized at 50 V, from the SEM analysis could be observed that respect of the ones on non-coated disks, Saos-2 are more flattened e interacting, especially on sample anodized at 50 V. Performed tests led to the production of an opened, regular and homogeneous nanotubular structure with a length of a dozen micron and diameter sizes tunable with the applied voltage value. This nanostructure enhances osteoblastic cells proliferation and could be also used as a local-drug delivery system for the release of molecules that could further increase Saos-2 bioactivity since the first moment after implantation. Could be interesting, in future, to evaluate if anodizing samples for less than 2 hours could offer the possibility to lower the applied voltage still removing the nanograss layer. This could give the opportunity to produce opened nanotubular structures with smaller diameters and then expand the biological characterization. This could be used also to extend the release experiment and better define the dependence of the drug loaded amount on nanotubes dimensions. Following tests, like ALP activity analysis on saos-2, could specifically prove that both nanotubes and the soybean-based biomaterial could increase the production of bone matrix and then enhance osteoblast differentiation and implant osseointegration.

Il titanio e le sue leghe sono tra i materiali più utilizzati in ambito biomedico come sostituti del tessuto osseo, grazie a caratteristiche come l'elevata biocompatibilità, adeguate proprietà meccaniche e alta resistenza alla corrosione. Sebbene la percentuale di successo di un impianto ortopedico o dentale sia molto elevata, il fallimento di questo tipo di device è solitamente improvviso. Le cause che possono determinare il fallimento di un impianto possono essere suddivise in fattori dipendenti dal paziente, come l'età, la qualità dell'osso, dalle caratteristiche dell'impianto, come le dimensioni o il tipo di finitura superficiale, e dal chirurgo, come la durata dell'operazione. La corretta fissazione di una protesi metallica dipende principalmente dall'osteointegrazione che avviene durante le prime fasi di guarigione. Dopo l'installazione, vi sono due possibili reazioni che possono avvenire all'interfaccia impianto-osso: un processo infiammatorio cronico che porta alla formazione di una capsula fibrotica, che causa il fallimento dell'impianto, o la formazione di tessuto osseo vitale e funzionale. Per questo motivo, sono stati sviluppati diversi trattamenti di modifica superficiale del titanio tramite i quali è possibile ottenere una superficie micro-rugosa che favorisca l'osteointegrazione dell'impianto senza l'interposizione di tessuto connettivo. Un esempio di questo tipo di trattamenti è rappresentato dalla tecnica di anodizzazione: un processo di passivazione elettrolitica usato per aumentare lo spessore dello strato di ossido che ricopre superfici metalliche, il quale favorisce l'integrazione tra impianto e osso. In particolare, utilizzando una soluzione contenente ioni fluoro, il trattamento di anodizzazione consente di ottenere una struttura nano-tubolare molto regolare. La regolarità, l'omogeneità e le dimensioni dello strato nanotubolare possono essere modulate variando i diversi parametri di processo come il tipo di elettrolita utilizzato, la durata del trattamento o il voltaggio applicato. Negli ultimi anni, data la relativa semplicità con cui possono essere prodotti, i nanotubi in ossido di titanio (TiO2 NTs) sono stati oggetto di numerosi studi per valutare la loro applicabilità nel campo biomedicale come rivestimento per protesi in titanio. E' emerso che questa nanostruttura presenta numerosi vantaggi rispetto al titanio puro o superfici micro-rugose, come ad esempio l'incremento della biocompatibilità e dell'attività cellulare, le quali dipendono dalle dimensioni dei nanotubi utilizzati. Inoltre, i nanotubi hanno destato grande interesse poichè possono essere caricati con molecole bioattive e usati come device per un rilascio controllato di farmaco localizzato nella sede d'impianto e il cui andamento dipende dalle loro dimensioni. Tra le sostanze che potrebbero essere caricate in un sistema a rilascio di farmaco con lo scopo di favorire l'osteointegrazione, vi sono dei biomateriali prodotti utilizzando una polvere costituita da estratti di soia. Le proprietà di questi estratti sono state confrontate da altri autori con quelle di altri biomateriali naturali (ad esempio collagene, chitosano o alginato) ed è stata dimostrata la possibilità di poter utilizzare queste sostanze come rivestimenti biodegradabili nell'ambito della rigenerazione dei tessuti. Le promettenti caratteristiche degli estratti di soia sono dovute alla presenza al loro interno degli isoflavoni: una famiglia di molecole con un comprovato effetto positivo sul metabolismo osseo. E' stato dimostrato, infatti, che gli isoflavoni come la genisteina e la daidzeina favoriscono la produzione di matrice ossea in sistemi di coltura cellulare. In particolare, la genisteina ha dimostrato di poter di inibire l'attivazione degli osteoclasti, cellule responsabili del riassorbimento osseo durante il rimodellamento del tessuto, favorendo quindi l'osteointegrazione. Inoltre, è stato anche dimostrato che la genisteina possiede la capacità di bloccare la proliferazione cellulare ed avere effetto antitumorale. Scopo di questo progetto è quindi produrre una struttura nanotubolare che possa incrementare l'adesione cellulare ed essere anche usata per controllare il rilascio di molecole bioattive che potrebbero ulteriormente favorire l'osteointegrazione. In particolare, l'obiettivo è definire l'insieme di parametri che consenta la formazione di una struttura nanotubolare omogenea, regolare, con uno spessore che garantisca la resistenza meccanica dello strato di nanotubi, i.e. intorno a una decina di micrometri. I nanotubi dovranno anche avere diametri modulabili al variare del potenziale applicato per consentire la valutazione di come il rilascio di isoflavoni e l'attività di cellule osteoblastiche siano influenzati dalle dimensioni dei nanotubi. Per valutare come le variabili di set-up influissero sulla geometria e la regolarità della struttura nanotubolare, campioni di titanio puro di grado 2, con diverse rugosità, sono stati trattati in due tipi di soluzione (una a base acquosa ed una organica) e applicando voltaggi e tempi diversi. I vari campioni sono stati osservati tramite analisi SEM e l'idrofilicità delle diverse superfici è stata valutata mediante un test di bagnabilità. Sono stati quindi selezionati due tipi di strutture con dimensioni dei pori differenti e queste sono state caricate per immersione con un gel contenente gli isoflavoni e l'andamento del rilascio di genisteina nel tempo è stato studiato al variare della geometria dei nanotubi, mediante analisi spettrofometrica dei supernatanti. Inoltre, una cromatografia su strato sottile delle sostanze rilasciate ha consentito di confermare che gli estratti utilizzati contenessero i due isoflavoni principali, genisteina e dadzeina, e le loro forme non-attive. Quindi, i diversi tipi di campioni sono stati caratterizzati biologicamente: mediante stainings a base di falloidina ed analisi SEM, è stato valutato come la proliferazione e la morfologia di cellule osteoblastiche di linea fossero influenzate dalla presenza dei nanotubi e dell'estratto della soia. I test di anodizzazione effettuati con la soluzione acquosa hanno mostrato che un approccio di tipo potenziostatico, rispetto a quello galvanostatico, è necessario per avere la possibilità di variare le dimensioni dei diametri dei nanotubi modulando il potenziale applicato. Inoltre, trattamenti in soluzione a base di etilen-glicole hanno dimostrato che l'utilizzo di un elettrolita organico, rispetto ad una soluzione acquosa, porta alla formazione di una struttura maggiormente ordinata con nanotubi con pareti lisce e lunghezze maggiori. Si è osservato, tuttavia, che con questo tipo di soluzione si forma superficialmente uno strato irregolare e disordinato, chiamato ''nanograss'', più o meno compatto a seconda della durata del trattamento. Secondo letteratura, la formazione di questa struttura superficiale dipende dalla rugosità della superficie di partenza. Per questo motivo, sono state scelte tre lastre con diverse rugosità: la lastra 2 presentava una lavorazione superficiale più fine della 1, mentre la lastra 3 è stata sottoposta ad un processo di elettrolucidatura. I campioni sono stati quindi trattati alle stesse condizioni, i.e. 60 V per 6 h, e si è visto che la presenza dello strato di nanograss diminuisce all'aumentare della qualità della superficie. In particolare, il campione con la Ra minore risulta essere totalmente privo dei residui superficiali, ma lo strato di ossido formatosi ha mostrato una bassissima aderenza alla superficie di titanio sottostante e, perciò, per i successivi esperimenti sono stati utilizzati campioni con rugosità intermedia. E' emerso successivamente che trattare i campioni per 20 secondi in ultrasuoni, alla fine del processo di anodizzazione, porta alla quasi totale rimozione dello strato di nanograss, consentendo l'ottenimento di nanotubi scoperti senza dover passare per un pre-trattamento come quello di elettrolucidatura. Questo metodo, tuttavia, risulta efficace solo per anodizzazioni con una durata superiore alle 2 ore, poichè trattare il campione per un tempo minore porta superficialmente alla formazione di uno strato poroso compatto che non viene rimosso dagli ultrasuoni. Anodizzando, inoltre, più campioni per 2 ore a diversi voltaggi si è osservato che è possibile rimuovere lo strato superficiale se al sistema sono stati applicati almeno 50 V. Per quanto riguarda le dimensioni dei nanotubi, è stato provato che prolungando il processo di anodizzazione si può aumentare lo spessore dello strato nanotubolare, il quale come i diametri può essere incrementato anche applicando una maggiore differenza di potenziale. Una volta valutato come le dimensioni dei nanotubi fossero influenzate dai vari parametri di processo, sono stati selezionati i parametri che consentissero la produzione due gruppi di campioni anodizzati a due diversi voltaggi, e quindi aventi nanotubi con dimensione dei diametri differenti. Test di bagnabilità della superficie hanno permesso di osservare che l'idrofilicità delle superfici nanotubolari è più elevata rispetto a quella del titanio puro ed aumenta per nanotubi di diametri maggiori. Per quanto riguarda il rilascio di farmaco, in linea con lavori precedenti, l'andamento di genisteina e genistina da parte dei nanotubi presenta inizialmente un rilascio istantaneo ed elevato ed una successiva fase di rilascio dopo circa 24 ore. A parità di concentrazioni utilizzate per caricare i campioni, i campioni anodizzati hanno mostrato una maggior quantità di molecole rilasciate rispetto al titanio non trattato ed, inoltre, l'ammontare di farmaco caricato risulta crescente con le dimensioni dei nanotubi ottenuti, specialmente per quanto riguarda la molecola genisteina. La coltura di cellule osteoblastiche sui diversi campioni ha mostrato che, per quanto riguarda l'adesione e la morfologia cellulare, in colture della durata di 24 ore gli osteoblasti rimangono tra loro isolati e presentano, rispetto a quelli su titanio puro, una forma più arrotondata, tipica delle prime fasi di adesione cellulare. Prolungando la coltura oltre 48 ore, la linea cellulare assume una forma più squadrata, appiattita e sono visibili interazioni tra cellule adiacenti, soprattutto sui campioni con nanotubi più piccoli. Per quanto riguarda la proliferazione cellulare, essa aumenta in presenza dei soli nanotubi, mentre diminuisce sui dischetti ricoperti con l'estratto di soia. In particolare, questi effetti sono più marcati sulle superfici con nanotubi di dimensione maggiore. Considerando i campioni caricati con gli isoflavoni, invece, attraverso lo staining dei filamenti di actina mediante falloidina non si notano particolari differenze morfologiche rispetto agli altri campioni. Tuttavia, dall'analisi SEM dei dischetti sembra che in presenza del rivestimento le cellule siano maggiormente estese e comunicanti tra loro, specialmente sui campioni anodizzati a 50 V. Questo progetto ha permesso di definire come, nel set-up a disposizione, la morfologia e le dimensioni di nanotubi in ossido di titanio fossero influenzati dai parametri del processo di anodizzazione con cui questi vengono prodotti. Inoltre, le prove effettuate hanno condotto alla definizione di un set di parametri che consente la produzione di uno strato nanotubolare con spessore dell'ordine della decina di micrometri e diametri modulabili tramite la variazione del potenziale applicato. Questa nanostruttura favorisce l'adesione e aumenta la proliferazione di cellule osteoblastiche di linea. Inoltre, può essere utilizzata come sistema di rilascio di farmaco, poichè è in grado di caricare e poi rilasciare molecole che possono favorire ulteriormente la produzione di matrice ossea fin dalle prime ore dopo l'impianto. Sarebbe interessante in seguito esplorare tempi di anodizzazione più lunghi, per valutare se sia possibile per durate maggiori ridurre il potenziale applicato e quindi produrre nanotubi con diametri minori. Questo consentirebbe di ampliare lo studio relativo al rilascio di farmaco in relazione ai diametri dei nanotubi ed il loro effetto su cellule osteoblastiche. Inoltre, l'analisi dell'attività della fosfatasi alcalina sulla linea cellulare saos-2 in presenza dei nanotubi e degli isoflavoni sarebbero utili per dimostrare quantitativamente come i diversi substrati influiscano sulla produzione di matrice ossea, sul differenziamento osteoblastico e quindi sull'effettiva osseointegrazione dell'impianto.