Injectable hydrogels for single surgery tracheal occlusion in congenital diaphragmatic hernia

Approximately 1 in 2,500 to 1 in 4,000 live births suffer of Congenital Diaphragmatic Hernia (CDH). The pathology arises when the embryonic pleuroperitoneal membranes cannot develop correctly, creating an orifice through which abdominal viscera come up by pressure gradient. The severe outcome of this condition consists in pulmonary hypoplasia, as the pleural cavity in which lungs should develop is invaded by lower organs. Previous studies showed that an inversion of the natural pressure gradient can successfully push back the herniated viscera, restoring –although partially- the physiological conditions. This goal was accomplished by tracheal occlusion. Nowadays, the FETO technique is clinically acknowledged and executed in the most severe cases for this proposal. It consists in the minimally invasive insertion of a Latex balloon within the tracheal cavity by ultrasounds-guided fetoscopy. Since many risks are associated with the procedure, this work aimed to substitute the device with an injectable soft material plug which could autonomously degrade, thus avoiding a second surgery for removal, and that would not damage the tracheal endothelium. Injectable, biodegradable and non-cell adhesive Calcium-alginates and Hyaluronan-Methylcellulose (HAMC) hydrogels were developed as alternatives for the target application. The former proposal is an in situ gelling hydrogel, whose reticulation is time- dependent and resulted fully controllable by the inner gelation method. The optimization of all parameters, as either the amount of polymer (3.5%, 4% and 5% w/v), the Calcium Carbonate content (44.2 mM, 50.5 mM and 63.1 mM) and the hydrolysis time of the reticulation agent glucono-δ-lactone (molar ratio CaCO3:GDL of 1:2) in solution, provided a slow gelation time (ranging from 4 to 7 min), selectable among a variety of possible combination. The second alternative, in turn, was tested as a hydrogel formed prior to injection, which can be inserted through small diameter needles thanks to its self-thinning properties. The influence of HA on methyl cellulose in the overall blend was analyzed for molar ratios of 1:3, 2:7, 3.5:7 and 4:8 HA:MC. The sol-gel transition temperatures were achieved at very cool temperatures, generally below 5°C, by exploiting the salting-out effect of both PBS and HA on methylcellulose. All hydrogels were tested in vitro for injectability through a 18 G needle, pressure resistance, swelling and degradation kinetics, cells adhesion and cytotoxicity.

L’Ernia diaframmatica prenatale (Congenital Diaphragmatic Hernia, CDH) ha un’incidenza che varia da 1 su 2.500 a 1 su 4.000 neonati. La patologia deriva da uno sviluppo incompleto delle membrane pleuro-peritoneali che, nel richiudersi al di sopra degli organi addominali, generano un’apertura tra la cavità pleurica e quella inferiore. In tal modo, si origina un gradiente pressorio che spinge gli organi sottostanti il diaframma a risalire attraverso il difetto, occupando lo spazio riservato allo sviluppo dei polmoni. L’ipoplasia polmonare che ne consegue si presenta come il maggior fattore di rischio per la sopravvivenza e la nascita dei bambini affetti da CDH. É stato ampiamente argomentato che un’occlusione del tratto tracheale può produrre effetti benefici per la formazione dei polmoni: se aumenta la pressione presente nel tratto respiratorio, gli organi erniati tendono, almeno parzialmente a ritornare in sede. Ad oggi, la pratica clinicamente riconosciuta per l’occlusione tracheale è la tecnica FETO, effettuata durante la fase sacculare dello sviluppo embrionale. La procedura consiste nell’inserimento di un palloncino in Latex rigonfiabile in situ, attraverso un’operazione chirurgica mininvasiva guidata da ultrasuoni. Attualmente, la FETO è ancora associata ad un alto tasso di fallimento e a svantaggi di diversa natura ed è praticata solo nei casi con aspettative di vita nulle o molto basse. Pertanto, in questo studio si propone di migliorarne gli effetti complessivi attraverso la sostituzione del dispositivo in uso con un soft material iniettabile, che possa degradare in modo autonomo, in modo da evitare un secondo intervento chirurgico per la sua rimozione, e tale da non ledere alle pareti endoteliali. Per l’applicazione proposta, sono state sviluppate in alternativa due tipologie di idrogeli iniettabili, biodegradabili e non adesivi per le cellule: l’alginato di calcio ed un blend di metilcellulosa ed acido ialuronico (HAMC). Il primo si presenta come un idrogelo in grado di gelificare in situ, la cui reticolazione dipende dal tempo e risulta totalmente controllabile attraverso il metodo della gelazione interna. L’ottimizzazione complessiva dei parametri, come la quantità di polimero (3,5%, 4% e 5%) e CaCO3 (44,2 mM, 50,5 mM and 63,1 mM) ed il tempo di idrolisi del glucono-δ-lactone (GDL) in soluzione usato come agente reticolante (rapporto molare CaCO3:GDL di 1:2), ha prodotto tempi di gelazione compresi tra 4 e 7 minuti, selezionati in un ampio spettro di possibili combinazioni. D’altro canto, l’HAMC è stato testato come idrogelo iniettabile nella sua forma pre- gelificata, che può essere inserito atraverso microcateteri di diametro ridotto grazie alle sue proprietà self-thinning. L’influenza dell’acido ialuronico sulla metilcellulosa nel blend complessivo è stata analizzata per rapporti molari di 1:3, 2:7, 3,5:7 e 4:8 HA:MC. Le temperature di transizione sol-gel sono state ottenute a valori molto bassi, generalmente sotto i 5 °C, sfruttando l’effetto salting-out derivante dall’utilizzo combinato di PBS e HA sulla metilcellulosa. Tutti gli idrogeli sono stati testati in vitro per iniettabilità attraverso un ago 18G, resistenza a pressione, cinetiche di degradazione e swelling, adesione cellulare e citotossicità.