Validazione sperimentale di dispositivi microfluidici provvisti di strutture idrodinamiche di tipo Herringbone per la cattura cellulare via adesione selettiva

Over recent years, regenerative medicine progresses gave the use of stem cells growing importance as a mean for autologous tissues regeneration; indeed, these cells are able to differentiate on multiple cell lines, depending on the kind of chemical, mechanical or electrical stimuli they are subject to. Stem cells are collected through tissue biopsy at specific tissue regions (called niche) or from bone marrow, typically from the same patient, in order to prevent immunologic response. A lot of isolation techniques for stem cells have been developed; in literature, two different traditional approaches are distinguished: techniques based on physical parameters, as cell density or dimension, and techniques based on chemical affinity. However these traditional approaches have some problems, such as low cellular sample purity, high cost, high processing time... that lead to new isolation techniques research. Between these innovative techniques, one particularly interesting is the specific adhesion of stem cells to functionalized surfaces using aptamers (artificial oligonucleotides) obtained through a technique called SELEX. This technique’s main advantage, in comparison to other techniques such as those ones based on antibody labeling, is that it uses a tag-free approach; therefore, it is not necessary to know specific markers expressed by target cells, leading to this technique simple applicability to other cell types. A technique for the catch-and-release of target cells using aptamer-conjugated electroactive oligopeptide SAM has been proposed by Enomoto et al. in a publication dated 2017. The aptamer was obtained by SELEX technique and is specific for a cell line of human hepatome called HepG2. Selectivity of the functionalized surface is given by both the cell-repulsivity of the peptidic layer and the aptameric ability to have specific interactions only with target cells. A microfluidic approach is highly synergic with the majority of the existing isolation techniques and, in particular, with ones based on specific adhesion of target cells to functionalized surfaces; indeed, microfluidic shows the capability of reducing processing time and sample consumption, while keeping isolation efficiency. Cell-isolating microfluidic devices’ main problem is that the micro-channel geometry needs to drive cells to the functionalized surfaces. In 2002, Stroock et al. designed a channel structure, called Herringbone, as a tool for micro-metric flow mixing. In subsequent years, this geometry has been used as a mean to improve cell adhesion to functionalized surfaces, based on the fact that mixing causes the maintaining of a stable cell concentration near to capture regions. Herringbone-like micro-structures (Figure S.4) appears to be extrusions on micro-chamber surfaces, at which the fluid can flow through. Structural units can have different shapes, but they are always designed to generate a flow component transverse to the main flow direction; this leads to typical helicoidal flow generation, responsible of fluid mixing. A specific study on the definition of a computational model for Herringbone-like devices has been conducted later after by Bianchi et al., with the purpose of evaluating changes in Herringbone’s fluid-dynamic behavior varying Herringbone’s shape and principal dimensions, thus defining, among those proposed, the most efficient Herringbone-like geometry at incrementing the number of surface-cell contact. The scope of the present work is the empirical characterization of the microfluidic devices with Herringbone-like geometries described in Bianchi et. al., in order to quantify their capture efficiency as compared with their non-Herringbone counterpart and to detect the best one for future application in the field of cell isolation by selective adhesion. The selected Herringbone geometries - shown in Figure S.5 - characterize the upper surface of microchannels with inlet section of 100 μm in height and 1080 μm in length. The abovementioned devices are fabricated in PDMS from silicon wafers through soft-lithographic methods, and subsequently sealed to rectangular glass microscope slides by plasma-bonding. Preliminary validation of the devices was conducted by functionalizing their lower surface with biotinylated polylysine and simulating the circulating cells’ behaviour by pumping streptavidin-coupled beads (average diameter: 10,5 μm) onto the surface. The beads were placed in a PBS solution with a concentration of 100 000 beads/mL. The experimental protocol entails the injection of 3000 beads into the microchannels through a syringe pump and the subsequent quantification of the beads that adhered to the substrate on microscopic images. The experimental setup is shown in Figure S.6. The flow rate was selected in a range between 5 e 45 μL/min, so that the microchannel flow speeds were consistent with the methodology established in previous studies testing Herringbone microchannels. As the microchannels’ heights may vary from their nominal value due to inhomogeneities in the silicon wafer, the obtained data were normalized to the area of the devices’ section, so that they could be visualized with regard to the effective flow speed. Other experiments were carried out to detect and quantify the presence of non-specific bonds led by the beads’ sedimentation on the surface. Therefore, counter beads were incorporated by saturating the streptavidin on the external surface of the beads with a fluorescent-labeled biotin shell. The resulting fluorescence’s evenness brings evidence for a correct coverage. The main preliminary results show data in regard to: • The quantification of the global capture-efficiency of the devices with the selected Herringbone geometries; • The analysis of the beads’ and the counter beads’ distribution in the devices • The evaluation of the presence of sedimentation in the smooth microchannels and in the Herringbone-like microchannels; the quantification of non-specific bonds; • The analysis of the beads’ adhesion (as well as the counter beads’ one) with regard to the shear stress calculated at the lower surface of the microchannels; • The quantification of the capture efficiency of devices designed to be five times wider than their counterparts; • The quantification of the capture efficiency of devices designed to be three times longer than their counterparts. From the results obtained from the validation conducted with the beads we concluded that: • The devices provided with Herringbone-like structures are more efficient than the smooth channels when used at speed higher than 240 mm/min. Within this range and among the geometries tested, the more virtuous is the asymmetric single tip Herringbone; • The device without Herringbones is more efficient at operating speeds lower than 220 mm/min. However, within this speed range, a high number of specific contacts due to sedimentation are observed, equivalent to an average of 50% of the beads captured by the substrate; • Sedimentation in devices with Herringbone-like structures is produced by the stationing of the beads in the side areas or in those areas affected by low values of shear stress; • High values of shear stress generally tend to create adverse conditions for the beads-substrate interaction. Locally, beads are distributed on the surface giving priority to those fields where the shear stress takes lower values. In general, the devices characterized by averagely higher values of shear stress appear to be less efficient; • Increasing by 5 times the devices’ width results in an increasing of their overall efficiency, and it confers a benefit upon the two asymmetric geometries when used at high speed; however, it doesn’t affect their reciprocal trend; • Increasing by 3 times the devices’ length results in an increasing of their efficiency especially at high speed, where capture ratio is higher; furthermore, it affects the particles distribution, whose concentration decreases from inlet to outlet. As the speed increases, the herringbone microchannel shows a more consistent efficiency increment when compared to both the smooth microchannel and the wider version with the same geometry. Based on these conclusions, it is possible to suggest the deployment of devices provided with Herringbone-like structures for cell isolation, and to use them both at lower speeds, since the devices are less subjected to sedimentation (compared to their smooth counterpart), and at higher speeds, because of the higher values of capture efficiency. In particular, the two best configurations are: 1. The device three times longer with the asymmetric single-tip Herringbone (Figure S.2 (c)), to be employed ad operating speed equal to 280 mm/min, if the aim is the processing of large amounts of fluid; 2. The device three times longer with asymmetric double-tip Herringbone (Figure S.2 (d)), to be employed at operating speed equal to 100 mm/min, if the aim is to maximize the specific capture efficiency. Finally, attempts have been made to validate the examined devices by using cells, properly adjusting the protocol of aptamer-mediated selective cell capture proposed by Enomoto. The main differences with the original protocol lie in the use of rectangular microscope slides instead of squared ones, in the conjugation of peptide and aptamer within the devices, and in the application of the plasma-bonding upon the surfaces. The cells involved in the validation are tumor line HepG2 and human BMSC in mixed solution. Preliminary tests have been carried out for the purpose of verifying the reproducibility of the results of Enomoto’s trial in a different operating environment; a good functioning of the functionalized surface is observed, with HepG2 specific capture efficiency of around 30%, that is comparable for value and purity standards to the specimen obtained from the Enomoto’s group results. Tests highlighted however the widespread presence of HepG2 cluster on the surface, and this provided reason for re-suspending the cells in FACS buffer (a common antiplatelet solution) in the following experiments. The validation of the devices with cells has been afterwards obstructed by an issue: no cells within the channels have been detected in any of the trials at the end of incubation, except for few isolated clusters of HepG2 and BMSC. Further trials have been carried out beforehand, and they allow to exclude from the causes of failure: • The effect of the prolonged incubation of the cells in FACS buffer; • Differences of the cellular adhesion microscope slides of different typology; • The effect of the presence of any traces of chromium in solution in the microchannels; • The effect of the plasma treatment on the slides’ and the channels’ surfaces. Given these considerations, it is assumed that the problem lies in the aptamer malfunctioning, due to its interaction with superficial charges induced by the plasma-bonding: these charges would force a conformational change in its structure, moving the aptamer away from its optimal configuration for cells’ attachment. In order to validate this assumption, an experimental protocol could be devised without the involvement of plasma-bonding treatment, for example by adopting a holder to be designed with this purpose.

Negli ultimi anni, i continui progressi nell’ambito della medicina rigenerativa hanno attribuito crescente importanza all’utilizzo di cellule staminali per la generazione di innesti autologhi, interesse che nasce principalmente dalla loro capacità di differenziarsi in molteplici linee cellulari a seconda del tipo di stimoli chimici, elettrici e meccanici a cui sono sottoposte. Le cellule staminali vengono prelevate mediante biopsia di tessuto a livello di regioni definite nicchie staminali o del midollo osseo, tipicamente dal medesimo paziente ricevente l’innesto, onde evitare risposta immunogenica. Numerose tecniche per l’isolamento di queste cellule sono state sviluppate. In letteratura si distingue tra due principali filoni di tecniche tradizionali ormai consolidate: tecniche basate sui parametri fisici, quali densità e dimensione cellulare, e tecniche basate sull’affinità di tipo chimico. Questi approcci tradizionali presentano però problematiche legate alle basse purezze dei campioni cellulari ottenuti, ai costi elevati ed agli elevati tempi di processo, che hanno portato alla ricerca di nuove tecniche di isolamento. Tra queste tecniche innovative, una particolarmente interessante è l’adesione specifica delle staminali a substrati funzionalizzati mediante l’utilizzo di aptameri (oligonucleotidi artificiali) ottenuti attraverso la tecnica SELEX. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle principali concorrenti, spesso basate sull’utilizzo di anticorpi come marker, risiede nel fatto che è una tecnica “tag-free”: non è dunque necessario conoscere la natura di specifici marker espressi dalle cellule bersaglio per poterla isolare, il che rende la tecnica applicabile con relativa semplicità a differenti tipi cellulari. Una tecnica per la cattura selettiva da campioni eterogenei mediata da aptameri è proposta da Enomoto e collaboratori in una pubblicazione del 2017, ed è incentrata sulla funzionalizzazione di una superficie d’oro con complessi SAMs-aptamero. L’aptamero è ottenuto con tecnica SELEX ed è specifico per la linea di epatomi umani HepG2. La selettività della superficie funzionalizzata è il prodotto della repulsività manifestata dal layer peptidico all’adesione di campioni cellulari e della capacità dell’aptamero, coniugato al layer sottostante, di avere interazioni specifiche con le sole cellule target. Un approccio microfluidico risulta altamente sinergico con la maggior parte delle tecniche di isolamento esistenti e, in particolare, con quelle basate sull’adesione specifica delle cellule bersaglio a substrati funzionalizzati: è infatti in grado di ridurre i tempi di processo ed il consumo di reagenti e campioni, pur mantenendo l’efficienza nominale di isolamento della tecnica stessa. La problematica principale nell’impiego di dispositivi microfluidodinamici in questi ambiti è legata al fatto che la geometria dei microcanali utilizzati deve essere in grado di spingere il flusso di cellule verso le superfici stesse. Stroock e collaboratori idearono, nel 2002, una microstrutturazione superficiale denominata “Herringbone” (lisca di pesce, per la forma caratteristica) come dispositivo per la miscelazione di flussi di fluido su scala micrometrica. La geometria pensata da Stroock trovò applicazione negli anni successivi come strumento per incentivare l’adesione di cellule a substrati funzionalizzati, basandosi sul fatto che la presenza di una miscelazione comporti il mantenimento di una concentrazione cellulare stabile in prossimità delle regioni di cattura. Le microstrutturazioni superficiali di tipo Herringbone (Figura S1) si presentano come delle estrusioni verso l’esterno della camera nelle quali il fluido ha la possibilità di scorrere. Le unità strutturali possono avere forme differenti ma tali per cui il fluido che ivi scorre acquisisca una componente di moto trasversale alla direzione principale del flusso; tale componente determina la formazione di moti elicoidali, caratteristici di questa categoria di dispositivi, responsabili del mescolamento del fluido. Uno studio specifico sulla progettazione computazionale di geometrie Herringbone ottimizzate per la cattura cellulare è stato successivamente condotto da Bianchi e collaboratori, con lo scopo di valutare l’effetto della variazione di alcuni parametri geometrici sul comportamento fluidodinamico dei dispositivi, e individuare, fra quelle proposte, la geometria più efficiente nel massimizzare il numero di contatti con la superficie funzionalizzata. L’obiettivo del presente lavoro è la caratterizzazione sperimentale dei dispositivi microfluidici a geometria Herringbone proposti nello studio di Bianchi e collaboratori, con l’obiettivo specifico di quantificarne l’efficienza di cattura rispetto al loro equivalente non provvisto di Herringbone, e individuarne uno migliore di altri, nella prospettiva di un futuro utilizzo di questi per l’isolamento cellulare via adesione selettiva. Le geometrie Herringbone selezionate sono quelle rappresentate in Figura S.2, e caratterizzano la superficie superiore di microcanali con sezione d’ingresso di altezza 100 μm e larghezza 1080 μm. I dispositivi d’interesse sono realizzati in PDMS, a partire da stampi in silicio prodotti in camera bianca con le tecniche della microfabbricazione soft-litografica, e successivamente integrati a vetrini rettangolari da microscopia mediante plasma-bonding. Una validazione preliminare dei dispositivi è stata effettuata funzionalizzando la loro superficie inferiore con un substrato di polilisina biotinilata e simulando il comportamento delle cellule circolanti all’interno con beads streptavidinate di diametro medio di 10,5 μm. Le beads sono messe in soluzione in PBS a concentrazione di 100 000 beads/mL. Il protocollo sperimentale adottato prevede l’inserimento di un numero totale di 3000 beads nei canali con l’ausilio di una pompa a siringa, e la successiva quantificazione delle beads aderite al substrato da immagini acquisite al microscopio. In Figura S.3 è presente una raffigurazione del setup sperimentale. Le portate di prova sono state selezionate in un range compreso tra 5 e 45 μL/min, di modo da ottenere velocità di flusso nei canali allineate rispetto a test condotti su microcanali a geometria Herringbone già presenti in letteratura. Dal momento che le altezze dei canali possono discostarsi dal valore nominale di progetto a causa di disomogeneità introdotte sul master in silicio durante la fabbricazione, i dati ottenuti sono stati normalizzati rispetto all’area di sezione dei canali, per visualizzarli in funzione della velocità effettiva del flusso. Si sono inoltre condotti esperimenti al fine di verificare e quantificare la presenza di attacchi non specifici dovuti a sedimentazione delle beads sulla superficie; sono state prodotte allo scopo delle counter beads saturando la streptavidina presente sulla superficie esterna delle beads con un guscio di biotina fluorescente. L’uniformità della fluorescenza risultante dà prova dell’ottenimento di una corretta copertura. I principali risultati ottenuti dalla valutazione preliminare sono relativi a: • Quantificazione dell’efficienza di cattura globale dei dispositivi con le geometrie Herringbone selezionate; • Analisi della distribuzione delle beads e delle counter beads all’interno dei dispositivi; • Valutazione della presenza di sedimentazione nel canale a sezione rettangolare e nei canali a geometria Herringbone, e quantificazione degli attacchi non specifici; • Analisi dell’adesione delle beads e delle counter beads rispetto agli sforzi di taglio calcolati in corrispondenza della superficie inferiore dei microcanali; • Quantificazione dell’efficienza di cattura in dispositivi cinque volte più larghi; • Quantificazione dell’efficienza di cattura in dispositivi tre volte più lunghi. Dalla valutazione dei risultati della validazione con le beads si è giunti alle seguenti conclusioni: • I dispositivi a geometria Herringbone sono più efficienti del canale a sezione rettangolare quando utilizzati a velocità di lavoro superiori a 240 mm/min. All’interno di questo range di velocità, tra le geometrie testate la più virtuosa è quella a punta singola alternata; • Il dispositivo a sezione rettangolare è più efficiente degli Herringbone a velocità di lavoro inferiori a 220 mm/min. Tuttavia, in questo range di velocità si osserva un elevato numero di attacchi non specifici dovuti alla sedimentazione, mediamente pari a circa il 50% delle beads catturate dal substrato; • La sedimentazione nei dispositivi a geometria Herringbone è prodotta dallo stazionamento delle beads nelle zone di parete a velocità nulla o in corrispondenza di regioni caratterizzate da bassi valori degli sforzi di taglio; • Elevati valori degli sforzi di taglio tendono in generale a creare condizioni sfavorevoli all’interazione delle beads col substrato. Localmente, le beads si distribuiscono sulla superficie privilegiando i campi in cui gli sforzi di taglio assumono valori meno alti. In generale, i dispositivi caratterizzati da valori di sforzi di taglio mediamente più alti risultano meno efficienti. • Aumentare di cinque volte la larghezza dei dispositivi ne aumenta complessivamente l’efficienza e avvantaggia le due geometrie asimmetriche nel punto di lavoro a maggiore velocità; non ha effetti invece sul loro comportamento globale. • Aumentare di tre volte la lunghezza dei dispositivi ne migliora l’efficienza soprattutto nel punto di lavoro a maggiore velocità, dove si hanno rapporti di cattura più elevati; ha inoltre effetto sulla distribuzione delle particelle, la cui concentrazione diminuisce dall’ingresso verso l’uscita. L’incremento di efficienza avvantaggia il canale provvisto di Herringbone rispetto al liscio, ma anche rispetto alla versione allargata della stessa geometria, in modo più consistente all’aumentare della velocità. Sulla base di queste conclusioni, è possibile suggerire l’utilizzo di dispositivi a geometria Herringbone per l’isolamento cellulare in punti di lavoro corrispondenti sia a velocità basse, in quanto i dispositivi sono meno soggetti a sedimentazione rispetto al loro equivalente liscio, sia a velocità maggiori, per via dei più alti valori di efficienza di cattura. Nello specifico, le due configurazioni reputate migliori sono: 1. Il dispositivo a geometria Herringbone con punta singola alternata (Figura S.2 (c)) tre volte più lungo, da utilizzare a velocità di lavoro pari a 280 mm/min, se l’interesse è di processare grandi quantità di fluido; 2. Il dispositivo a geometria Herringbone con doppia punta alternata (Figura S.2 (d)) tre volte più lungo, da utilizzare alla velocità di lavoro di 100 mm/min, se l’interesse è di massimizzare l’efficienza di cattura specifica. Infine, si è tentato di validare i dispositivi in studio con le cellule, adattando opportuna- mente il protocollo di cattura selettiva mediata da aptameri proposto da Enomoto all’impiego dei microcanali. La principale differenza col protocollo originario risiede nell’utilizzo di vetrini rettangolari invece di vetrini quadrati, nella coniugazione di peptide e aptamero direttamente all’interno dei dispositivi, e nell’applicazione del trattamento col plasma sulle superfici di vetrino e canale per il bonding. I campioni cellulari utilizzati per la validazione sono HepG2 e BMSC di linea in soluzione mista. Test preliminari sono stati condotti con lo scopo di verificare la riproducibilità dei risultati dello studio di Enomoto in un ambiente di lavoro diverso; quello che si osserva è un buon funzionamento della superficie funzionalizzata, con efficienza di cattura specifica delle HepG2 pari circa al 30%, confrontabile per valore e per purezza di campione ottenuto ai risultati del gruppo di Enomoto. I test evidenziano tuttavia la presenza diffusa sui vetrini di cluster di HepG2, che ha motivato la scelta di risospendere le cellule in FACS buffer, un comune antiaggregante, negli esperimenti successivi. La validazione dei dispositivi con le cellule è stata in seguito impedita da una problematica: in nessuna delle prove sono state rilevate cellule all’interno dei canali al termine del tempo di incubazione, ad eccezione di qualche cluster isolato di HepG2 e BMSC. Ulteriori prove erano state effettuate preliminarmente e permettono di escludere dalle cause dell’insuccesso: • L’effetto dell’incubazione prolungata delle cellule in FACS buffer; • Differenze nell’adesione cellulare su vetrini di diversa tipologia; • L’effetto della presenza di eventuali tracce di cromo in soluzione nei microcanali; • L’effetto del trattamento al plasma delle superfici dei vetrini e dei canali. Al netto di queste considerazioni, si suppone che il problema risieda in un malfunzionamento dell’aptamero legato ad interazioni con cariche superficiali introdotte dal plasma-bonding; queste ne forzerebbero il cambio conformazionale, allontanando l’aptamero dalla sua configurazione ottimale per l’attacco delle cellule. Per validare l’ipotesi si potrebbe ideare un protocollo sperimentale che non preveda il bonding dei microcanali ai vetrini col plasma, per esempio utilizzando un holder da progettare per lo scopo.