Improvement of the clone selection strategy : multi-step DoE for the optimization of media and feed for mAbs production

During the last 50 years the development of genetic engineering has allowed to modify organisms in order to make them express a protein of interest. Since more than 20 years, the demand of recombinant proteins for therapeutic needs is continuously growing. To be in line with the increasing demands of biologic molecules, the industry has to develop new tools to improve the titers of the cell lines used. At Merck Serono in Vevey, the selection of the most productive clone consists of several steps. After transfection with the gene of interest, cells are tested in static and agitated condition and the clones giving the best titers are selected. Since the same platform parameters are used during the entire selection process, this raises the question whether the chosen clones are indeed the most performant ones or just the more adapted to those conditions. So, the aim of this work was to prove that, by changing the media composition, an increasing in titer may be achieved. In this work, different clones of two cell lines, CHO-S and CHO-K1, were used. A sequentially aproach is adopted and design of experiments (DoE) are done according to the selections obtained after an accurate decision trees (DTs) analysis of a previous set of results. At the beginning of this work, the results of a previous study conducted at Merck were analyzed with DTs. This experiment was performed with 5 different clones and 11 groups of AAs at different levels were tested. The analysis of the results obtained at WD14 led to the conclusion that the selections are clone specific and for this reasons it is not possible to find a recipe for the medium which is equal for every cell line. The first experiment done was conducted with two different clones, P04 and T11, on the same plate and with the same platform condition, with the aim to evaluate the repetition errors. The repetition errors were not acceptable, as CVs were higher than 20\%, due to two principal reasons: first of all, the grey silycon membrane was used on the plate; secondly, the plates used to measure the VCD were not coated. Indeed, in a previous study it was emerged that the grey membranes lead to an early cell death in the middle of the plate and that the T11 cells tend to adhere to the bottom of the guava plate if this is not coated. Experiment 2 was split into two parts: the first one had the goal to evaluate the repetition errors in platform condition, while the second one was used to evaluate the effect of 3 of the 11 goups tested in experiment zero. In this case, two plates with equal conditions were evaluated and just one clone, P04, was considered. For the part regarding the repetition errors, better results were obtained compared to experiment 1, with CVs lower than 10\%. Regarding the media blending part, it was found that the selections obtained on the titer lead to higher productivity than platform medium. Experiment 3 was conducted on three plates, one for each clone (T15, T18 and T25), and different media and feed blending conditions were tested. It was chosen to test the groups that were found to be important in experiment zero. It was proved that, for all the clones, there were some conditions which performed better compared to the platform. In particular, it emerged that feed blending is not important compared to media blending. Experiment 4 was performed with the same clones but, in this case, it was chosen to test also some conditions in which media and feed blending were combined. Moreover, since it was emerged from experiment 3 that K in the medium needs to be increased, it was decided to enrich the platform medium in potassium at 150\% of the level in the standard medium. The results proved the importance of this salt showing that the productivity is slightly higher when the platform medium contains K than when it does not. The last two experiments were performed in STs and had the goal to validate the results obtained in 96-DWPs. Since the STs allow to have less conditions to test, it was chosen to evaluate just one clone, T18. The results obtained at WD10 were analyzed and the importance of K was again highlighted. In experiment 6 it was chosen to to try to fine tune the best level of K in both, the medium and the feed. The results obtained, verified the positive influence of potassium on the productivity but, unfortunately, this work was to short to be able to fine tune the best level of this salt. Moreover, since it was proved that there are always some conditions which perform better than the platform, it was demonstrated that the clone selection strategy should be changed. In particular the best way to operate would be to do the first fed batch with 20 clones and 20 conditions for each clone in DWPs, in order to find the optimal environment. Then, only the best 10 clones should be selected with their own best media to be submitted in the second fed-batch to different feeding strategies. After this, 4 clones with their best combination of media and feeding strategies should go through the last fed-batch. Only the clone that obtains the best final titer must be selected in this last fed-batch. After this selection, media, feeds and other parameters may go through another round of optimization.

Negli ultimi 50 anni lo sviluppo dell'ingegneria genetica ha permesso di modificare gli organismi con lo scopo di esprimere una proteina di interesse. Da oltre 20 anni la richiesta di proteine ricombinanti per esigenze terapeutiche è in continua crescita. Per essere in linea con la crescente domanda di agenti terapeutici, è necessario sviluppare nuovi strumenti per migliorare la produttività della linea cellulare utilizzata. Alla Merck Serono di Vevey, la selezione dei cloni più produttivi consiste di diversi step. In seguito alla tranfezione del gene di interesse, le cellule sono testate in condizioni statiche e dinamiche e i cloni più produttivi vengono selezionati. Dal momento che tutti questi step vengono svolti in condizioni standard, ci si pone la domanda se i cloni selezionati siano effettivamente quelli che producono meglio o se sono semplicemente quelli che meglio si adattano a quelle condizioni. Lo scopo di questo lavoro è quello di verificare che, cambiando le composizioni dei terreni di coltura, un aumento della quantità di anticorpi prodotta può essere raggiunto. In questo lavoro, vengono utilizzati diversi cloni di due linee cellulari, CHO-S e CHO-K1. Viene adottato un approccio sequenziale e gli esperimenti vengono designati secondo delle selezioni ottenute in seguito all' analisi dei risultati ottenuti in un precedente esperimento. All'inizio di questo lavoro, i risultati di uno studio precedente condotto alla Merck sono stati analizzati con alberi decisionali (DTs). Questo esperimento è stato eseguito con 5 diversi cloni e 11 gruppi di amminoacidi a diversi livelli sono stati testati. L'analisi dei risultati ottenuti al WD14 ha portato alla conclusione che le selezioni sono specifiche per ogni clone e, per questo motivo, non è possibile trovare una ricetta per il medium che sia uguale per ogni linea cellulare. Il primo esperimento fatto è stato condotto con due diversi cloni, P04 e T11, sulla stessa piastra e nelle stesse condizioni di coltura, al fine di valutare la ripetibilità. Gli errori ottenuti non erano accettabili, con coefficienti di variazione (CV) superiori al 20%, a causa di due ragioni principali: prima di tutto, è stata utilizzata la membrana in silicone grigia; secondo, le piastre utilizzate per misurare la VCD non erano state rivestite. Infatti, in uno studio precedente è emerso che le membrane grigie portano le cellule a una morte precoce al centro della piastra e che le cellule CHO-K1 tendono ad aderire al fondo della piastra, se questa non è rivestita. L' esperimento 2 è stato suddiviso in due parti: la prima ha avuto l'obiettivo di valutare la ripetibilità nelle condizioni standard, mentre la seconda stata utilizzata per valutare l'effetto di 3 degli 11 gruppi testati nell' esperimento zero. In questo caso, sono state valutate due piastre con condizioni uguali e solo il clone P04 è stato considerato. Per quanto riguarda la ripetibilità, sono stati ottenuti risultati migliori rispetto all'esperimento 1, con CV inferiori al 10%. Per quanto riguarda gli esperimenti in cui i mezzi di coltura sono stati mischiati, si è scoperto che le selezioni ottenute portano ad avere una produttività più elevata rispetto alle condizioni standard. L'esperimento 3 è stato condotto su tre piastre, una per ogni clone (T15, T18 e T25), e sono stati sperimentati diversi mezzi di coltura e diversi nutrienti. Si è scelto di testare i gruppi che si sono rilevati importanti nell' esperimento zero. è stato dimostrato che, per tutti i cloni, esistono alcune condizioni che migliorano le performance rispetto alle condizioni standard. L'esperimento 4 è stato compiuto con gli stessi cloni ma, in questo caso, si è scelto di combinare le tecniche di media blending e feed blending. In questo caso, è stato scelto di provare anche alcune condizioni in cui supporto e miscela di feed sono stati combinati. Inoltre, dal momento che è emerso dall'esperimento 3 che K nel medium deve essere aumentato, si è deciso di aggiungere al platform medium una quantità di potassio al 150% rispetto a quella presente nelle condizioni standard. I risultati hanno dimostrato l'importanza di questo sale mostrando che la produttività è nettamente superiore quando il K è aggiunto rispetto a quando non è presente. Gli ultimi due esperimenti sono stati eseguiti in ST; l'obiettivo era di convalidare i risultati ottenuti in 96-DWPs. Poichè gli spin tubes consentono di avere meno condizioni per la prova, si è scelto di valutare solo un clone, T18. I risultati ottenuti al WD10 sono stati analizzati e l'importanza di K è stata nuovamente evidenziata. Nell' esperimento 6 è stato scelto di cercare di trovare il livello ottimale di potassio. I risultati ottenuti dimostrano l' influenza positiva del potassio sulla produttività ma, purtroppo, questo lavoro è stato troppo breve per potere misurare la quantità ottimale di questo sale. Inoltre, dal momento che è stato dimostrato che ci sono sempre alcune condizioni che funzionano meglio di quella standard, si deduce che la strategia di selezione dei cloni dovrebbe essere modificata. In particolare il modo migliore per operare sarebbe quello di compiere la prima coltura fed-batch con 20 cloni e 20 condizioni per ogni clone in DWP, al fine di trovare l'ambiente ottimale. Quindi, solo i migliori 10 cloni dovrebbero essere selezionati per il secondo fed-batch, in cui i migliori terreni di coltura vengono combinati con diversi feed. Dopo di che, i 4 migliori cloni vengono selezionati per il terzo fed-batch con le loro migliori combinazioni di medium e feed. Solo il clone che ottiene il miglior titolo finale deve essere selezionato in questo ultimo fed-batch. Dopo questa selezione, i mezzi di coltura, i feed e altri parametri potrebbero essere ulteriormente migliorati.