Light sheet microscopy with adaptive optical elements : implementation, control and characterization

One of the main challenges in optical imaging is the development of microscopy techniques able to observe fast dynamic processes, over a large field of view, at high spatio-temporal resolution and over a long period of time. A microscopy technique that exhibits these peculiarities is Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM). In this technique a fluorescent sample is illuminated by a thin “light sheet” that can be created using a laser beam focused by cylindrical lens, and fluorescence light emitted by the light sheet is collected by an objective lens in the direction perpendicular to the illumination axis. A 3D reconstruction of the sample can be achieved by translating the sample through the light sheet in the imaging chamber. The goal of this thesis work was to develop a light sheet microscope that could be used to study mm-scaled objects, at high resolution, avoiding the need to translate the sample in the imaging chamber. In order to achieve these goals, first, a new microscope was constructed, incorporating a galvo-scanner to move the light sheet within the sample and an adaptive (electrically tunable) lens to keep the image in focus on the detector. Second, a software to control the instrument was fully developed (using Labview code), able to trigger the scan of the galvo, the tunable lens and camera acquisition simultaneously. A state machine was implemented to run the software and to provide the user with the ability to rapidly calibrate the setup and acquire a full stack of images during the sample scan. Finally, the system was validated using different reference targets, the specifications of the system were assessed and measurements of various fluorescent specimens were performed, including Arabidopsis thaliana roots and Danio rerio (zebrafish), expressing fluorescent proteins in different cellular compartments.

Una delle principali sfide nell'imaging ottico è lo sviluppo di tecniche di microscopia in grado di osservare processi dinamici veloci, in un ampio campo visivo, ad alta risoluzione temporale e per un lungo periodo di tempo. Una tecnica di microscopia che mostra queste peculiarità è la microscopia di fluorescenza a foglio di luce (in inglese LSFM). In questa tecnica, un campione fluorescente viene illuminato da un sottile "foglio di luce", che può essere prodotto facendo focalizzare un fascio laser collimato da una lente cilindrica, mentre il segnale di fluorescenza emesso dalla zona illuminata dal foglio di luce viene raccolta da una obiettivo ottico in direzione perpendicolare all'asse di illuminazione. Una ricostruzione 3D del campione può essere quindi ottenuta traslando il campione stesso attraverso il foglio di luce nella camera del campione. L'obiettivo di questa di tesi è quello di sviluppare un microscopio a foglio di luce che può essere utilizzato per studiare oggetti su scala millimetrica, ad alta risoluzione, evitando di traslare il campione nella camera del microscopio. Per raggiungere questi obiettivi, in primo luogo, è stato costruito un nuovo apparato, incorporando uno specchio galvanometrico per spostare il foglio di luce all'interno del campione e una lente adattativa (tunabile elettricamente), per mantenere l'immagine a fuoco sul rivelatore. In secondo luogo, un software per controllare lo strumento è stato completamente sviluppato (in ambiente Labview), in grado di attivare contemporaneamente la scansione dello specchio motorizzato, della lente tunabile e l'acquisizione del sensore. Il software è stato implementato come una macchina a stati per fornire all'utente la possibilità di calibrare rapidamente il setup e acquisire una stack completa di immagini durante la scansione del campione. Infine, il sistema è stato avvalorato utilizzando diversi target ottici di riferimento, sono state quindi valutate le specifiche del sistema e sono state eseguite misure su diversi campioni fluorescenti, tra cui radici Arabidopsis thaliana e Danio rerio (zebrafish), che esprimono proteine fluorescenti in diversi compartimenti cellulari.