Comparison of spontaneous and coherent Raman spectroscopy for biophysical analysis

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy is a non-invasive labelfree ultrafast spectroscopy method based on intrinsic vibrational contrast and is characterized by high sensitivity, high spectral resolution and 3D-sectioning capability. The present work its based on its extended implementation called multiplex or broadband CARS (MCARS) in which two synchronized laser pulse trains of narrowbandwidth pump and a broad-bandwidth Stokes pulse are used to simultaneously excite all Raman frequencies from 500 up to 3500 cm−1, of particular interest in biological applications. The stimulated frequencies are the same as in spontaneous Raman spectroscopy but, due to the creation of coherent light, they are emitted with an intensity which is several order of magnitude higher. The main disadvantage of the technique is due to the presence of a non-resonant background that alters the spectral shape and the position of the resonance peaks or even mask them, limiting the sensitivity of the system. A solution to the problem is represented by the Maximum Entropy Phase Retrieval (MEPR) algorithm, able to estimate the phase of third order electrical susceptibility and to re-construct Raman spectra. The method has been successfully applied for the characterization of polymers, human epithelial tissue and chemical solutions containing the triple bond C≡N, these latter of particular interest in the biological eld. It has been proved that MEPR is not only able to retrieve qualitative Raman information but also to perform quantitative (concentration) measures. The study of rats brain tissue samples has shown that the MCARS setup is able to distinguish healthy tissue from tumorous tissue. The last part of experimental work, particularly innovative, involves the monitoring of an enzymeinhibitor reaction whose velocity depends on the pH of the solution. It has been observed that if the reaction is su ciently slow, Raman spontaneous spectroscopy is able to record the evolution of the system; if the pH level increases, the reaction is accelerated and only a higher performance setup, such as the MCARS system, can detect real-time data.

Questo lavoro nasce da una collaborazione con il Physikalisch-Chemische Institut (Istituto di Chimica-Fisica) della Ruprecht-Karls-Universität di Heidelberg. Lo studio é incentrato sullo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di un setup sperimentale per la spettroscopia Raman coerente anti-Stokes a larga banda (multiplexcoherent anti-Stokes Raman scattering, MCARS). Attraverso l'utilizzo di due treni di impulsi laser ultrabrevi, sincronizzati in spazio e tempo, é possibile stimolare l'emissione di luce alle stesse frequenze anti-Stokes della spettroscopia Raman spontanea ma, data la creazione di onde coerenti, l'intensitá ottenuta risulta diversi ordini di grandezza maggiore. Pertanto la spettroscopia MCARS si sta a ermando velocemente come tecnica di imaging non distruttiva, non legata all'uso di coloranti e con tempi di acquisizione piú veloci della spettroscopia Raman spontanea. Lo svantaggio principale della tecnica é dovuto alla presenza di un background non risonante che altera la forma spettrale e la posizione dei picchi di risonanza e puó, eventualmente, oscurarli del tutto, limitando la sensibilitá del sistema. Una soluzione al problema é rappresentata dall'algoritmo di ricostruzione di fase a massima entropia (Maximum Entrophy Phase Retrieval, MEPR), in grado di stimare la fase della suscettivitá elettrica del terzo ordine e di ricostruire spettri Raman. Il metodo é stato applicato con successo per la caratterizzazione di polimeri, tessuto epiteliale umano e soluzioni chimiche contenenti il triplo legame C≡N, queste ultime di particolare interesse in campo biologico. È stato dimostrato che la MEPR é non solo in grado di ricostruire spettri Raman in modo qualitativo ma anche di e ettuare misure quantitative (di concentrazione). Lo studio di campioni di tessuto cerebrale di ratti ha dimostrato che il setup MCARS é in grado di distinguere il tessuto sano da quello tumorale. L'ultima parte del lavoro sperimentale, particolamente innovativa, riguarda il monitoraggio di una reazione enzima-inibitore la cui velocitá dipende dal pH della soluzione. Si é osservato che se la reazione é su cientemente lenta, la spettroscopia Raman spontanea é in grado di registrare l'evoluzione del sistema; se il pH aumenta, la reazione é accelerata e solo un setup con prestazioni piú elevate, quale é il sistema MCARS, puó rilevare dati in tempo reale.