Synthesis and characterization of targeted nanoparticles for drug delivery to glioblastoma

This thesis was focused on the synthesis and characterization of targeted nanoparticles for drug delivery to glioblastoma through blood-brain barrier (BBB). Glioblastoma multiform (GBM) is one of the two most common high-grade astrocytomas and it remains almost universally fatal despite new diagnostic tools and maximal therapy. In the case of brain tumor, drug-loaded nanoparticles with a size of about 100 nm are able to penetrate the blood–brain barrier; moreover, their functionalization with polyethylene glycol (PEG) gives to nanoparticles “stealth” properties, allowing them to escape from in vivo defense mechanisms, such as the opsonization one. For this reason, most nanosized delivery systems are made up of micellar amphiphilic polymers that consist of PEG and a low molecular weight hydrophobic core-forming block such as poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) or poly(lactic) acid (PLA); the hydrophobic core serves as a natural carrier environment for hydrophobic drugs and the hydrophilic shell allows the particle stabilization in aqueous solution. Moreover PEG and PLGA based polymers are known to be non-toxic GRAS (generally recognized as safe) and FDA-approved. We report herein the development of a polymeric micellar nanoparticles based on PLGA-b-PEG-COOH copolymers, entrapping the drug doxorubicin within their PLGA core. The resulting polymeric nanoparticles have been chemically conjugated to chlorotoxin (Ctx), a 36-amino acid peptide that specifically binds to metalloproteinase-2 (MMP-2), a receptor over-expressed by brain cancer (glioma cells). Micelles Preparation, Drug Encapsulation, and Peptide Conjugation have been deeply investigated with the aim to get the final polymeric nanoparticles with high yield, purity, drug loading and controlled size, suitable for biological applications. With this aim, commercial dyes such as Rhodamine B, Rhodamine 800, and Rhodamine B-Ester and Benzylamine have been used to model doxorubicin and conjugated ligand, respectively. Experimental data and results will be presented. The preliminary release diagram of drug has been studied, and biological experiments are ongoing.

Questo lavoro di tesi è stato focalizzato sulla sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle opportunamente funzionalizzate per il trasporto mirato di farmaci (drug delivery) al glioblastoma, attraverso la barriera emato-encefalica. Il glioblastoma multiforme (GBM) è uno dei due più comuni astrocitomi con alto grado di malignità, ed è solitamente fatale, nonostante innovative tecniche di diagnosi e terapia. Nel caso di tumori cerebrali, nanoparticelle con una taglia di circa 100 nm possono oltrepassare la barrier emato-encefalica; inoltre, è noto che la funzionalizzazione delle nanoparticelle con glicole polietilenico (PEG) conferisce loro la proprietà di scappare dai meccanismi biologici di difesa, come l’opsonizzazione. Per questa ragione, molti sistemi nanometrici per il trasporto mirato di farmaci sono micelle formate da polimeri anfifilici, costituiti a loro volta da PEG e da polimeri idrofobici a basso peso molecolare -che formano il core della micella-, come l’acido acido poli(lattico-co-glicolico) o l’acido poli(lattico) (PLA); il cuore idrofobico serve per incapsulare farmaci idrofobici, mentre la sfera esterna idrofilica permette alle particelle di solubilizzarsi in soluzione acquosa. Polimeri costituiti da PEG e PLGA sono anche non tossici e conosciuti come sostanze GRAS (generally recognized as safe), approvati dall’FDA. In questa tesi, abbiamo descritto lo sviluppo di micelle nanometriche costituite da copolimeri PLGA-b-PEG-COOH, in grado di incapsulare il farmaco doxorubicina nel loro cuore idrofobico. Le nanoparticelle così ottenute sono poi state coniugate alla clorotossina (Ctx), un peptide costituito da 36-amminoacidi e in grado di legare la metalloproteinase-2 (MMP-2), un recettore overespresso dai tumori cerebrali (gliomi). I processi di preparazione delle micelle, incapsulamento del farmaco e coniugazione del peptide sono stati approfonditamente studiati per ottenere le nanoparticelle polimeriche con alte rese e purezza, un alto livello di caricamento del farmaco, e una dimensione controllata opportuna per le applicazioni biologiche. A questo scopo, coloranti commerciali (come Rodammina-B, Rhodammina 800 e Rodammina B-estere) e la benzilammina sono stati utilizzati come modelli della doxorubicina e del peptide Ctx, rispettivamente. I dati sperimentali e i risultati ottenuti verrano qui presentati. I diagrammi di rilascio del farmaco sono stati preliminarmente studiati, e i test biologici sono ancora in atto.