Development of a perfusion system on custom environmental chamber for retinal recordings with MEA chip

1. Introduction and objectives Vision is one of the most prominent and fundamental abilities human beings possess, as most of our activities, such as navigating environments, recognizing familiar faces, and reading, are all guided, or at least aided, by the eye’s work [Ekstrom, 2015]. When any step of the visual pathway (the cornea, the lens, the retina, the optic nerve, the thalamus, and the visual cortex) is altered or sustains damage, low vision or blindness can occur [Ghezzi, 2015]. Since retinal dystrophies are one of the major causes of adult blindness in industrialized countries, in the last years much work has been done to come to a solution. Among the various clinical approaches, retinal prostheses were the only ones to reach the market, as they proved to be the most effective in restoring some visual function in blind patients [da Cruz et al., 2016]. During the development of a retinal prosthetic device, the characterization of electrical activity of the degenerated retina in animal models is of paramount importance, as it allows not only to better understand the progression of the retinal degenerative disease, but also to determine the optimal stimulus paradigms [Goo et al., 2016]. In spite of the presence of nearly undetectable changes in neuronal network properties caused by the unnatural environment in which they have been located, in vitro models represent a simplified framework to probe emergent electrophysiological activity patterns, expected to appear in biological neuronal ensembles [Giugliano and Martinoia, 2006]. In order to portray the retinal activity in a long span of time, such as the one needed to characterize retinal degeneration, incubators are used to maintain the explanted retinas in optimal conditions. To this general purpose, many groups devised custom-made environmental chambers, able to contemporarily preserve the cultures health and record the electrical activity. Due to the high metabolic consumption of retinas, perfusion systems need to be devised, in order to nourish the tissue with the appropriate amount of oxygen. In this framework, the aim of this work was the integration of a medium perfusion system on a custom environmental chamber previously built at the Neuroengineering and medical Robotics laboratory at Politecnico di Milano [Regalia et al., 2016], already equipped with climate-controlling elements and MultiElectrode Arrays (MEAs). The work has been conceived and carried out in collaboration with the CIS Experimental Imaging Center in San Raffaele Hospital and the LNE Laboratory in Neuroengineering at EPFL. The final setup was suitable for long-term recordings of explanted retinas, while assuring the best environment to prevent tissue degeneration. 2. Materials and methods The device used for this work, designed and prototyped by Giulia Regalia and coworkers at the NearLab, was a prototype of a culturing and recording chamber suited for neuronal cultures with dedicated spaces for four MEAs. The setup, shown in figure A, was composed of an environmental chamber, a control unit, the recording equipment and various elements that contributed to the environmental stability of the chamber: a humidifier for relative humidity, a circulating bath for chamber temperature, and a gas supplier for CO2 partial pressure. Figure A – General architecture of the experimental setup: climate-controlled chamber (light blue), environmental controlling devices (green) and control unit (pink). As the final purpose of the setup was to be able to record explanted retinas, many features were required. First, the previous functionalities needed to be assured, due to a non-activity state that lasted two years. Similarly, properties such as stability and portability, due to the subsequent moving to LNE in Geneva, were to be provided. Then, concerning the new purpose of the setup, a medium perfusion system for the cell cultures needed to be devised and incorporated. Requirements for this addition were an overall structure stability and the capability of delivering 1ml/min of medium to the cells, as previously done in [Schmidt et al., 2011]. The first phase of the work, conducted at the CIS laboratory, consisted in a general renovation of the device, that didn’t add any major functionality. In fact, at the start of this work, the whole setup was in a non-functioning state. Therefore, it was reassembled and renovated with particular attention to the previously mentioned features: stability and portability. The connections in the control unit were stabilized and the sensors were rewired with a series of plug-in/plug-out connectors. The proper control of the main environmental parameters, namely CO2 partial pressure and relative humidity percentage (RH%), was fixed: the CO2 sensor was recalibrated and the humidifying bottle insulated. During the second phase of the work, at LNE, the perfusion system was devised and integrated into the existing set-up: tubes delivering and extracting medium from the MEA chip were attached to the environmental chamber via a syringe, that was inserted in the hole above the MEA lodgment. A peristaltic pump, acting on both the tubes, provided the flow. In order to keep a stable level of the medium, the end of the outlet tube was floating at a higher level than the inlet tube, so that the medium level periodically reached the outlet tube and medium was sucked out. A trial and error approach was enough to find the optimal level of the tubes in the MEA chip, so that the risk of overflow was minimum but the culture still had enough medium in the surroundings. To provide oxygen and CO2 to the medium, the perfusion system was integrated with the oxygenation one, as can be seen in figure B. Once the hardware setup was assured to function properly, the first recording trials with medium alone showed a spike-like interference, inducing some problems on the spike sorting phase, as the recording software could not discriminate noise from signal. To solve it, two different solutions were tried: a software one, during the post-processing phase, and a hardware one, consisting in the grounding of the perfusion tubes, which eventually discarded the first solution for the sake of computational weight. Figure B – Diagram of the entire perfusion system. Thin lines represent tubes with air flowing. Thick lines are tubes where medium flows. As the third and last phase, experimental trials were carried out with degenerated retinas explanted from diseased mice. The data recorded from the cultures were processed to associate the time instants to all the recognized spikes. Subsequently, spiking times were fed into a MATLab algorithm to extract electrical activity parameters regarding spikes, bursts, and network bursts. 3. Results and discussion Successful achievements were obtained in all the three phases of the current work: hardware renovation, integration of the perfusion system and long-term retinal recordings. For what concerns the renovation of the experimental setup, the changes proved to be successful, as the moving and the reassembling in LNE was fast and without problems. The environmental control problems were also solved, returning environmental parameters compatible with the desired ones and drastically improved from the starting point, as can be seen in figure C. In figure D, an overview of all the controlled environmental parameters in a 6 hours-long span. Figure C – RH% levels before and after the insulating protection on the bottle The perfusion system was completely functioning as well, since it was possible to keep medium level stable in the MEA chip, while also completely removing the spike-like interferences that threatened to compromise the data. Moreover, thanks to a medium bottle change after two days, it was possible to maintain a retina in incubator for four days, before the electrical activity ceased: a demonstration of the satisfying medium renewal in the chip. Then a significant amount of data was recorded from the retina during the experimental phase, since up to 35 on 60 channels were active in the same time, and it was used to perform comparative analysis regarding activity, from simple spikes to the network burst level. A simple example, depicting the total number of spikes per minute, is represented in figure E. Figure E – Total number of spikes in all the channels in a four days period of time. On the x-axis is the time, in hours. On the y-axis the raw number of spikes. The experimentation proved to be very successful in the end, as we were able to record spontaneous activity for four days, and by being able to limit the contamination, a difficult task given the very nature of the tissue, explanted from a living animal, it’s likely possible to go even further in the long-term recording of an explanted retina. The firing features were comparable with other studies on the same line of diseased mice, showing both the spontaneous activity and the oscillatory burst nature described in [Goo, 2016]. For what concerns the duration of the experiment, to the best of our knowledge, there are no comparable experiments in literature, using a degenerated retina for a 4-days-long experiment. In fact, other works, such as in [Reinhard et al., 2014], only used healthy retinas for recordings long up to 6 hours. Recordings on degenerated tissues, such as in [Goo, 2016], where instead not classifiable as long-term.

1. Introduzione e obbiettivi La vista è una delle abilità più notevoli che l’uomo possiede, infatti la maggior parte delle nostre attività, dall’orientarsi in un ambiente, al riconoscere un volto familiare, fino alla lettura, sono tutte guidate, o quanto meno aiutate, dal lavoro dell’occhio. [Ekstrom, 2015]. Quando un qualsiasi stadio dell’elaborazione visiva (la cornea, il cristallino, la retina, il nervo ottico, il talamo, e la corteccia visiva) è alterato o danneggiato, un abbassamento della visione o addirittura cecità posso verificarsi [Ghezzi, 2015]. Dal momento che le distrofie retinali sono una delle maggiori cause di cecità in età adulta in paesi industrializzati, negli ultimi anni è stato fatto molto lavoro per giungere a una soluzione. Tra i vari approcci clinici, le protesi retinali sono state le uniche a raggiungere il mercato, in quanto si sono dimostrate le più efficaci nel ristabilire alcune funzioni visive in pazienti ciechi. [da Cruz et al., 2016]. Durante lo sviluppo di una protesi retinale, la caratterizzazione dell’attività elettrica di una retina degenerata in modelli animali è di primaria importanza, in quanto permette non solo di capire meglio la progressione della malattia degenerativa della retin, ma anche di determinare le modalità di stimolazione ottimali. [Goo et al., 2016]. Nonostante la presenza di differenze quasi impercettibili nelle proprietà di una rete neuronale in un ambiente artificiale, i modelli in vitro continuano a rappresentare un contesto semplificato nel quale indagare gli schemi emergenti di attività elettrofisiologica, attesi in contesti di complesse strutture neuronali. [Giugliano e Martinoia, 2006]. Con l’obbiettivo di rappresentare l’attività retinica in lunghi archi di tempo, assimilabili a quelli necessari per caratterizzare la degenerazione retinale, gli incubatori vengono utilizzati per mantenere le retine espiantate in condizioni ottimali. A questo fine, molti gruppi hanno sviluppato camere ambientali su misura, capaci contemporaneamente di preservare la salute delle culture e registrarne l’attività elettrica. A causa dell’alto consumo metabolico delle retine, anche sistemi di perfusione devono essere integrati, in modo da fornire al tessuto la necessaria quantità di ossigeno. In questo contesto, lo scopo di questo lavoro era l’integrazione di un sistema di perfusione del medium su una camera ambientale precedentemente costruita al Neuroengineering and medical Robotics laboratory, del Politecnico di Milano [Regalia et al., 2016], già attrezzata con elementi di controllo climatico e di registrazione tramite Multielectrode Arrays (MEAs). Il lavoro è stato ideato e sviluppato in collaborazione con il CIS Centro di Imaging Sperimentale dell’Ospedale San raffaele e il LNE Laboratory in Neuroengineering dell’EPFL. Il setup finale si è dimostrato adeguato a registrazioni a lungo termine di retine espiantate, assicurando allo stesso tempo l’ambiente ottimale per prevenire la degenerazione tissutale. 2. Materiali e metodi Il dispositivo utilizzato per questo lavoro, ideato e prototipato da Giulia Regalia e colleghi al laboratorio Nearlab, era il prototipo di una camera di cultura e registrazione, adattata per culture neuronali con quattro alloggiamenti MEA. Il setup, mostrato in figura A, era composto da una cameretta ambientale, un’unità di controllo, la strumentazione per registrare, e vari elementi che contribuivano alla stabilità ambientale della camera: un umidificatore per l’umità relativa, un bagnetto riscaldato per la temperatura, e una fornitura di gas per la pressione parziale di CO2. Figura A – Architettura generale del setup sperimentale: la camera di controllo climatico (in azzurro), i dispositivi di controllo ambientale (in verde) e l’unità di controllo (in rosa) Dato che l’utilizzo finale del setup sarebbe stato quello di registrare retine espiantate, erano richieste alcune caratteristiche. Per prime, le funzionalità preesistenti dovevano essere garantite, a causa di uno stato di non utilizzo protrattosi per due anni. Similarmente, dovevano essere introdotte proprietà come stabilità e portabilità, visto il preventivato trasloco all’LNE di Ginevra. Per ultimo, strettamente correlato al nuovo utilizzo del prototipo, doveva essere ideato e integrato un sistema di perfusione del medium per le culture. I requisiti per questa aggiunta erano una generale stabilità strutturale e la capacità di garantire 1ml/min di medium alle cellule, come descritto in [Schmidt et al., 2011]. La prima fase del lavoro, svolta al laboratorio CIS, consistette in un ristauro generale del dispositivo, senza l’aggiunta di alcuna funzionalità particolare. Infatti, all’inizio del lavoro, l’intero setup non era funzionante. Fu quindi riassemblato e rinnovato con particolare attenzione per le due caratteristiche sopracitate: stabilità e portabilità. Le connessioni nell’unità di controllo furono stabilizzate e i sensori ricablati con una serie di connettori plug-in/plug-out. Il controllo di due dei principali parametri ambientali, la pressione parziale di CO2 e la percentuale di umidità relativa, fu rimesso in funzione: il sensore di CO2 venne adeguatamente ricalibrato e il bottiglione umidificatore fu isolato termicamente. Nella seconda fase, all’LNE, fu ideato e integrato sul setup esistente un sistema di perfusione del medium: i tubi che trasportavano medium dentro e fuori dal MEA chip erano fissati alla camera ambientale tramite una siringa, che veniva inserita nel foro sovrastante l’alloggiamento del MEA. Una pompa peristaltica, agente su entrambi i tubi, era responsabile del flusso. Per mantenere stabile il livello di medium all’interno del chip, l’estremità del tubo di prelievo era sistemata a un’altezza maggiore rispetto a quella del tubo di diffusione, in modo tale che il livello del medium raggiungesse periodicamente il tubo più alto e venisse risucchiato. L’altezza ottimale dei due tubi fu trovata con un approccio empirico, in modo tale che il rischio di fuoriuscita fosse minimo ma comunque compatibile con un livello di medium che garantisse la sopravvivenza del tessuto. Per fornire ossigeno e CO2 al medium, il sistema di perfusione fu integrato con quello di ossigenazione, come si può osservare in figura B. Una volta assicurato che il setup funzionasse adeguatamente, le prime prove di registrazione, effettuate con il solo medium, mostrarono la presenza di interferenze simili a spike, che avrebbero posto problemi durante la fase di riconoscimento spike, in quanto il software di registrazione non era in grado di discriminare adeguatamente il segnale dal rumore. Per risolvere questo problema, furono provate due differenti soluzioni: una a livello software durante la fase di post-processing, l’altra a livello hardware, che consisteva nella messa a terra dei tubi di perfusione. Questa fu infine preferita, in quanto alleggeriva il carico computazionale in fase di processing. Figura B – Diagramma del Sistema di perfusione. Le linee sottili rappresentano tubi per l’aria, quelle spesse sono i tubi deputati allo scorrimento del medium. Durante la terza e ultima fase, furono portate a termine prove sperimentali utilizzando retine degenerate espiantate da topi ammalati. I dati registrati dalle culture furono processati associando ad ogni spike il suo istante temporale. A seguire, gli istanti degli spike venivano elaborati da un algoritmo MATLab, che restituiva parametri di attività elettrica riguardanti spike, bursts e bursts di rete. 3. Risultati e discussione In tutte e tre le fasi di questo lavoro di tesi (il rinnovamento hardware, l’integrazione del sistema di perfusione, e le registrazioni retinali a lungo termine) furono ottenuti risultati soddisfacenti. Per quanto riguarda il rinnovamento del setup sperimentale, le modifiche si dimostrarono adeguate, in quanto il secondo trasloco e successivo assemblamento presso l’LNE fu veloce e senza problemi. I problemi riguardanti il controllo ambientale furono risolti, risultando in parametri ambientali compatibili con quelli desiderati e drasticamente migliorati rispetto al punto d’inizio, come si può vedere in figura C. In figura D una panoramica dei parametri ambientali controllati in un intervallo di 6 ore. Figura C – Livelli di umidità relativa percentuale prima e dopo la protezione isolante sull’umidificatore. Il sistema di perfusione si dimostrò anch’esso perfettamente funzionante, in quanto era possibile mantenere stabile il livello di medium nel chip MEA; anche le interferenze, che minacciavano di compromettere l’abilità di riconoscere gli spike, furono eliminate. Inoltre, a dimostrazione dell’efficace perfusione di medium nel chip, e grazie al ricambio della bottiglia di medium dopo due giorni, fu possibile mantenere una retina espiantata in incubatore per quattro giorni consecutivi prima che l’attività elettrica cessasse. A seguito di questo soddisfacente esperimento è stata raccolta una significativa quantità di dati, tanto che 35 su 60 canali nel chip erano simultaneamente attivi. Questi dati furono utilizzati per dele analisi comparitive riguardanti l’attività elettrica su più livelli, dai semplici spike ai burst di rete. Un semplice esempio, che mostra il numero totale di spike per minuto, è rappresentato in figura E. Figura E – Numero totale di spike in tutti i canali in un periodo di 4 giorni. Sull’asse x è rappresentato il tempo, in ore; sull’asse y, il numero di spike Concludendo, gli esperimenti ebbero grande successo, in quanto fummo in grado di registrare l’attività spontanea della retina degenerata per quattro giorni consecutivi. Se fosse possibile limitare ulteriormente la contaminazione, un compito arduo visto la natura stessa del tessuto, espiantato da un animale vivo, è probabile che si possa migliorare ulteriormente questo risultato. Le caratteristiche di sparo era paragonabili con quelle di altri studi sulla stessa linea di topi malati, mostrando sia l’attività spontanea che la natura oscillatoria sotto forma di burst che viene descritta in [Goo, 2016]. In proposito della durata dell’esperimento, per quanto abbiamo trovato in letteratura, non sono presenti esperimenti paragonabili a quello effettuato in questo lavoro. Infatti, altri gruppi, come in [Reinhard et al., 2014], utilizzavano solo retine sane per registrazioni lunghe fino a 6 ore. Esperimenti su tessuto degenerato, come in [Goo, 2016], non erano invece classificabili come a lungo termine.