In-situ, non-invasive electrochemical monitoring of bone cell differentiation markers in a three-dimensional in vitro system

In vitro models are a key tool for studying the molecular basis of human diseases and developing new and more effective drugs for their therapeutic treatment. Recently, more attention is shifting towards three-dimensional in vitro models, that have been recognized as more representative models of the physiological 3D cellular microenvironment and, thus, of the in vivo cellular behaviour if compared to traditional two-dimensional cell cultures. However, before asserting 3D in vitro systems as conventional models for cell-based assays, there is the need to develop non-invasive and non-destructive techniques for the accurate cell fate analysis within the scaffold and throughout the culture period. Electrochemical techniques represent an attractive option, offering in-situ, non-invasive and non-destructive analysis of the 3D construct in a fast and cost-effective manner. This work highlights the possibility of monitoring a thick, 3D gelatin-based osteoblastic cell culture for bone disease research and drug screening applications by means of electrochemistry. Specifically, a pyrolytic carbon electrode was used to monitor Alkaline Phosphatase (ALP) activity, a biomarker of bone cell differentiation, using an electrochemical assay. At first, the electrochemical assay was adapted to the 3D system under consideration by studying the diffusion of assay analytes within the gelatin layer. Then, the sensor’s performances were examined, investigating the effect of the gelatin layer and culture medium on the electrochemical behaviour of the pyrolytic carbon electrode. Sensor calibration was further performed to correlate the electrical signals gained by the electrode to the ALP concentrations present in the 3D construct. Finally, the sensor was successfully used to monitor and quantify ALP activity in the 3D osteoblastic in vitro model at different culture times. The developed system was also employed to evaluate the effect of levamisole (an ALP inhibitor) on cultured cells.

I modelli in vitro sono strumenti fondamentali per lo studio delle malattie umane e per lo sviluppo di nuovi e più efficaci farmaci per il loro trattamento terapeutico. Ultimamente, le colture cellulari tri-dimensionali stanno ottenendo attenzione crescente in quanto modelli in vitro più efficaci rispetto alle tradizionali colture bi-dimensionali. Esse infatti riproducono con maggiore accuratezza l’ambiente tri-dimensionale dei tessuti viventi e, di conseguenza, il comportamento cellulare in vivo. Affinché tali colture si affermino come modelli in vitro convenzionali, è necessario sviluppare tecniche non invasive e non distruttive per monitorare le funzionalità cellulari all’interno dello scaffold durante tutto il periodo di coltura. Le tecniche elettrochimiche rappresentano un’opzione valida per un’analisi in-situ, non invasiva e non distruttiva del costrutto 3D in modo rapido ed economico. Il presente lavoro di tesi evidenzia la possibilità di monitorare una coltura cellulare 3D di osteoblasti in gelatina mediante l’utilizzo di tecniche elettrochimiche. In particolare, si è utilizzato un elettrodo di carbonio pirolitico per monitorare, tramite un saggio elettrochimico, l’attività della fosfatasi alcalina (ALP), un biomarker della differenziazione delle cellule ossee. Inizialmente, il saggio elettrochimico è stato adattato al sistema 3D in esame, studiando la diffusione degli analiti all’interno della coltura di gelatina. Successivamente sono state esaminate le performance elettrochimiche del sensore, valutando l’effetto della gelatina e del terreno di coltura sulle prestazioni dell’elettrodo. Infine, è stata eseguita la calibrazione del sensore, per correlare i segnali elettrici acquisiti dall’elettrodo con le concentrazioni di ALP presenti nella coltura 3D. Il sensore sviluppato è stato quindi utilizzato con successo per monitorare e quantificare l’attività di ALP all’interno del costrutto 3D a differenti tempi di coltura. Il sistema è stato inoltre impiegato per valutare l’effetto del levamisole (un farmaco utilizzato come inibitore dell’attività dell’ALP) sulla coltura cellulare.