Circulating tumor cells and early cancer detection : toward a high throughput lab-on-chip dynamic filtering of a blood sample

Cancer nowadays is among the leading causes of death world-spread. In this field, is estimated that almost the 90% of the cancer-related deaths are due to the development of metastases. In the recent years, thus, the research field has shown particular interest about this disease. In particular, a group of cells, called Circulating Tumor Cells (CTCs) have shown interesting peculiarities that could be used in the cancer struggle. These cells, that, once detached from the tumoral mass, enter in the blood circulation, seem to be at the basis of the metastatic spread process. Furthermore, many studies have found a significant clinical utility of the detection of these cells: such as poor prognosis prediction, early cancer detection, monitoring of both cancer progression and cancer therapy efficiency. One of the most challenging aspects of identification and isolation of these cells is represented by their rarity: it has been demonstrated, indeed, a CTC frequency of 1-1000 cells per blood ml, while the counts for the other blood cells (leukocytes and erythrocytes) are in the order of 〖10〗^6-〖10〗^8. This, in addition to the need for high efficiency and high throughput analysis techniques, led microfluidics to be very active in this field. For this reason, in the CNST-IIT facility of Milan, it has been conceived a big research project for the realization of a new microfluidic device that addresses all the up to now requirements. The key-words in order to create a device that could really be applied in the clinical routine, and thus, push forward the early cancer detection and the cancer struggle can be resumed in: low cost, high efficiency, high throughput, and, especially, completely label-free. The project will face this challenge taking advantage of a three steps integration strategy. The first step will filter the whole blood sample in input to remove from it as many erythrocytes as possible, thus enhancing the analysis time and the efficiency of the subsequent stages. The white blood cells and circulating tumor cells, coming out from this dynamic filtering, will be put in a row -one behind the other – to allow the third step to selectively identify the tumoral cells. However, this last step should not be thought of as a mere selection and counting passage: it implements, indeed, a Raman spectroscopy of the input particles. Thus, will give a greater amount of information about tumoral cells: it will not only be able to discriminate between CTCs and the other types of cells but it will also characterize each cell, assigning to it the spectrum of its chemical composition. Furthermore, CTCs have shown a great heterogeneity, also within the same cancer type: this innovative analysis method, thus, could help also to identify sub-groups in CTCs. This thesis represents, thus, the first step toward the creation of a lab-on-chip, opto-microfluidic and glass embedded device for the label-free CTC detection in a blood sample. In particular, it will face the challenge of implementing the first stage of the above-mentioned project, trying to exploit all the advantages offered by the innovative femtolaser micromachining followed by chemical etching (FLICE) technology. Among these, the most interesting characteristic is the capability of generating complex 3D structures -with almost no limitation in shape and dimension - buried in a fused silica substrate with a micrometric accuracy. Furthermore, it will propose new solution to improve this technique, in order to implement a more efficient and precise realization of on-a-chip microfluidic devices.

Al giorno d’oggi il cancro rappresenta una delle principali cause di morte nel mondo. In questo campo, è stimato che circa il 90% delle morti per cancro sia dovuto allo sviluppo di metastasi. Negli ultimi anni, quindi, il mondo della ricerca ha focalizzato la sua attenzione su questa malattia. In particolare, un gruppo di cellule, definite come cellule tumorali in circolazione (CTC) hanno dimostrato di aver particolari peculiarità che potrebbero essere utilizzate nella lotta al cancro. Queste cellule, una volta distaccate dalla massa tumorale, penetrano nella circolazione sanguigna e sembrano essere alla base del processo di diffusione metastatica. Molti studi hanno, inoltre, dimostrato una significativa utilità clinica del processo di detezione di queste cellule come ad esempio: la predizione di scarsa prognosi, il rilevamento precoce del cancro, il monitoraggio sia della progressione del cancro che dell’efficacia delle terapie utilizzate per combatterlo. Uno degli aspetti più impegnativi rappresentati dall’identificazione e isolamento di queste cellule è dato dalla loro rarità: è stato dimostrato, infatti, che possono essere presenti in un numero di 1-1000 per ml di sangue, mentre i conteggi delle altre cellule del sangue (leucociti ed eritrociti) sono dell’ordine di 〖10〗^6 - 〖10〗^8. Questo, in aggiunta alla necessità di tecniche di analisi ad alta efficienza e alto throughput, hanno portato la microfluidica ad essere molto attiva in questo campo. Per questo motivo, nei laboratori del CNST@IIT di Milano, è stato concepito un grande progetto di ricercar per la realizzazione di un Nuovo dispossitivo microfluidico che soddisfi tutti gli attuali requisiti. Le parole chiave per la creazione di un dispositivo che possa realmente trovare applicazione in campo clinico, e quindi, dare una spinta alla detezione precoce del cancro e alla lotta contro di esso , possono essere riassunte in: basso costo, alta efficienza, alto throughput, e, soprattutto, completamente label-free. Il progetto affronterà questa sfida, sfruttando i vantaggi di una strategia integrata, divisa in tre principali sezioni. Il primo blocco si occuperà del filtraggio del sangue preso in ingresso, per rimuovere da esso quanti più eritrociti sia possibile, migliorando così il tempo di analisi degli step successivi. I globuli bianchi e le CTC rimanenti, che usciranno dal blocco di filtraggio dinamico, saranno quindi poste in riga -una dietro l’altra – per permettere alla terza sezione di identificare in modo selettivo le cellule tumorali. Questo ultimo step, tuttavia, non deve essere pensato solo come passaggio di mera selezione e conteggio: implementa, infatti, una spettroscopia Raman delle particelle in ingresso. Questo fornirà una maggiore quantità di informazioni sulle cellule tumorali: non solo, infatti, sarà in grado di distinguere tra CTC e altri tipi di cellule ma sarà anche capace di caratterizzare ogni cellula, assegnandole uno spettro della sua composizione chimica. In aggiunta, le CTC hanno anche dimostrato una grande eterogeneità anche all’interno dello stesso tipo di cancro: questo metodo di analisi innovativo, quindi, potrà aiutare anche nell’identificazioni di tali sottogruppi. Questa tesi, quindi, rappresenta il primo passo verso la creazione di un dispositivo lab-on-chip, opto-microfluidico e completamente integrato in un substrato di vetro per la rilevazione label-free di CTC nel sangue. In particolare, affronterà la sfida di implementare la prima sezione del progetto presentato sopra, cercando di sfruttare tutti i vantaggi offerti dall’innovativa tecnica di micromachining tramite femtolaser, seguito da etching chimico (FLICE). Tra questi uno dei più interessanti è fornito dalla capacità di genrare complesse strutture 3D – con quasi nessuna limitazione nella forma e nella dimensione – integrate in substrati di vetro con un’accuratezza micrometrica. Verranno, inoltre, presentate nuove soluzioni per migliorare questa tecnica, al fine di raggiungere fabbricazioni più efficienti e precise di chip microfluidici.