Design and development of in vitro tools for Cancer Tissue Engineering

Predictive models of human tumors are of paramount importance for studies of tumor initiation, progression and remission, identification of therapeutic targets, and development of new therapeutic modalities. Animal models have greatly contributed to our understanding of cancer, but their value in anticipating the effectiveness of treatment strategies in clinical trials remains uncertain. In vitro testing of anticancer drugs typically involves growing cancer cell lines in monolayers on tissue-culture plastic dishes. Despite major progresses, monolayer cultures remain poor predictors of whether a given drug will be safe and ultimately provide clinical benefit. Most in vitro models, including tumor spheroids, cancer cells in scaffolds, and small cancer organoids lack the complexity of the native tumor milieu that mediates cancer processes. Bioengineering methods that have advanced stem cell research and regenerative medicine are becoming essential tools for cancer research. Importantly, bioengineered tumors can provide cancer cells with a tissue context incorporating the extracellular matrix (ECM), supporting cells and physical signals. However, increasing the complexity of cancer models may be a successful strategy only if crucial components of a tumor are identified, replicated and controlled in vitro. In this Ph.D. thesis, we developed methods to engineer in vitro human bone tumors, in the effort to introduce substantial improvements over existing 3D models to study bone malignancies. In the first part of the project, we show that biomechanical signals have major effects on cancer cell growth and drug sensitivity, using a bioengineered model of human bone sarcoma. Mimicking bone-like mechanical signals within the 3D model, we rescued important mechanotransduction pathways in tumor cells. Anticancer drugs failed to block this molecular pathway and cell growth in mechanically stimulated cancer cells. By culturing patient-derived xenografts in the bioengineered tumor model, we confirmed the effects of mechanical signals on cancer cell survival and drug sensitivity. In the second part of the Ph.D. thesis, we show the feasibility of developing a bone perivascular niche-on-chip model that incorporates the application of interstitial flow to investigate breast cancer metastatic homing and drug resistance. The model represents a functional human tri-culture with stable microvascular networks within a three-dimensional (3D) native bone matrix cultured on a microfluidic chip. Providing the niche-on-chip with physiologically-relevant flow velocities, shear stresses, and oxygen gradients, we achieved and maintained a long-lasting, self-assembled microvascular network without supplementation of angiogenic factors. We also show that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells that have undergone phenotypical transition toward perivascular cell lineage support the formation of capillary-like structures lining the vascular lumen. Finally, we demonstrate that breast cancer cells exposed to interstitial flow within the bone perivascular niche-on-chip, persist in a slow-proliferative state associated with increased drug resistance. In this Ph.D. thesis, using tissue engineering techniques, we have demonstrated the feasibility of integrating biomechanical cues into preclinical cancer models. First, we showed that mechanical loading in the bone affects the response to anticancer drugs. Second, we demonstrated that interstitial fluid flow induces a slow proliferative state in cancer cells homing the bone reducing the efficacy of targeted therapy. Overall, we anticipated that bioengineered human preclinical models will become crucial to better predict patients’ responses to anticancer drugs.

I modelli predittivi dei tumori umani sono fondamentali per studi sull'iniziazione tumorale, sulla progressione e sulla remissione, sull'identificazione dei bersagli terapeutici e sullo sviluppo di nuove modalità terapeutiche. I modelli animali hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione del cancro, ma il loro valore per anticipare l'efficacia delle strategie di trattamento negli studi clinici rimane incerto. Il test in vitro di farmaci antitumorali comporta tipicamente la crescita delle linee di cellule tumorali nei monostrati su piatti in plastica. Nonostante grandi progressi, le culture monostrato rimangono scarsi predittori dell’efficacia di un farmaco. La maggior parte dei modelli in vitro, inclusi sferoidi tumorali, cellule tumorali in scaffolds e piccoli organoidi tumorali, non dispongono della complessità dell'ambiente tumorale nativo che media i processi cancerosi. I metodi di bioingegneria utilizzati nella ricerca sulle cellule staminali e la medicina rigenerativa stanno diventando strumenti essenziali per la ricerca sul cancro. I modelli di tumore avanzati possono fornire alle cellule tumorali un contesto tissutale che incorpora la matrice extracellulare (ECM), sostenendo cellule e segnali fisici. Tuttavia, aumentare la complessità dei modelli di cancro può essere una strategia di successo solo se i componenti fondamentali di un tumore sono identificati, replicati e controllati in vitro. In questo tesi di dottorato, abbiamo sviluppato metodi per ingegnare in vitro tumori ossei umani, nel tentativo di introdurre miglioramenti sostanziali rispetto ai modelli esistenti per. Nella prima parte del progetto dimostriamo che i segnali biomeccanici hanno importanti effetti sulla crescita delle cellule tumorali e sulla sensibilità dei farmaci, utilizzando un modello ingegnerizzato del sarcoma umano osseo. Simulando segnali meccanici simili a quello osso all'interno del modello 3D, abbiamo riespresso importanti percorsi di meccanotransduzione nelle cellule tumorali. I farmaci antitumorali non sono riusciti a bloccare questa via molecolare e la crescita cellulare nelle cellule tumorali meccanicamente stimolate. Coltivando xenografts derivanti da pazienti nel modello tumorale ingegnerizzato, abbiamo confermato gli effetti dei segnali meccanici sulla sopravvivenza delle cellule tumorali e la sensibilità dei farmaci. Nella seconda parte della tesi, mostriamo la fattibilità di sviluppare un modello di nicchiaperivascolare su un chip microfluidico, che incorpora l'applicazione del flusso interstiziale per indagare la cascata metastatica del cancro al seno e la resistenza ai farmaci. Il modello rappresenta una tri-cultura umana funzionale con reti microvascolari stabili all'interno di una matrice ossea nativa tridimensionale (3D) coltivata su un chip microfluidico. Esponendo la nicchia a velocità di flusso fisiologicamente rilevanti, sollecitazioni di taglio e gradienti di ossigeno, abbiamo ottenuto e mantenuto una rete microvascolare di lunga durata e autoassemblata senza integrazione di fattori angiogenici. Inoltre dimostriamo che le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che sono state sottoposte a una transizione fenotipica verso le linee cellulari perivascolari, supportano la formazione di strutture capillari simili al lume vascolare. Infine, dimostriamo che le cellule tumorali del seno esposte al flusso interstiziale all'interno dell'osso, persistono in uno stato di lenta proliferazione, associato ad una maggiore resistenza ai farmaci. In questa tesi di dottorato, utilizzando tecniche di ingegneria tissutale, abbiamo dimostrato la fattibilità dell'integrazione di segnali biomeccanici nei modelli preclinici del cancro. In primo luogo, abbiamo mostrato che il carico meccanico nell'osso influenza la risposta ai farmaci antitumorali. In secondo luogo, abbiamo dimostrato che il flusso di liquido interstiziale induce uno stato proliferativo lento nelle cellule tumorali che risolvono l'osso riducendo l'efficacia della terapia mirata