Pancreatic islet microencapsulation: development of a comprehensive platform for evaluation and optimization of conformal coating with hydrogels for clinical applications

Pancreatic islet transplantation aims at replacing beta-cells, targets of autoimmune attacks in type 1 diabetes mellitus. To prevent graft rejection, patients require chronic immunosuppression, which is not completely effective and can cause adverse events. Therefore, islet transplantation is currently performed only in the most severe cases. Immunoisolation through islet encapsulation may allow transplantation without immunosuppression, but clinical success has yet to be achieved. The aim of this PhD dissertation is to present a new encapsulation device for conformal coating of islets with PEG-based polymers through a micro fluidics device. The work presented focuses on overcoming some limitations of traditional islet microencapsulation by: i) reducing the volume to be transplanted by decreasing capsule thickness; ii) enhancing capsule stability by using PEG-based polymers, iii) optimizing the transplantation site in order to favor encapsulated islets engraftment, iv) optimizing coating composition by enhancing PEG-hydrogels with ECM components, v) developing methods to allow high-throughput screening of candidate materials for conformal coating using computational models and lab-on-chip technology, vi) proving proficiency of conformal coating to cell therapy approaches in contexts different from diabetes. Thin conformal coatings were obtained using a fluid dynamic approach: the water jet forming between two immiscible fluids (oil and water) flowing coaxially gets broken through the use of a flow-focusing geometry. The obtained droplets consist of islets covered in a thin polymer layer. The fluid dynamic process was first studied in silico through a computational model and then evaluated in vitro by comparing prototype devices. Islets were encapsulated using polyethylene glycol-divinyl sulfone supplemented with alginate and cross-linked with dithiothreitol (PEG ALG). The encapsulation did not compromise viability and function both in vitro and in vivo in a syngeneic murine transplantation model at the renal sub capsular site (KD). A study about the effects of capsule composition and transplant site on microencapsulated islet graft outcomes in mice was carried out. The epididymal fat pad (EFP) proved to be a superior site in terms of long-term diabetes reversal. Addition of PEG to alginate to form hybrid microcapsules improved diabetes reversal time in the peritoneal cavity site, most likely by conferring higher mechanical protection to the capsules. This was not the case in the EFP site, where the lower biocompatibility of the hybrid capsule might have a played a role in longer reversal time and poorer glycemic control. PEG ALG coatings failed to achieve long-term normoglycemia in an allotransplantation context. This might have been related to their microporous structure. In order to improve transplantation outcomes, PEG divinyl sulfone functional groups were replaced with the less reactive maleimide groups, and the KD site with the EFP site. ALG was replaced by Matrigel (MG), in order to recapitulate the islet-like extracellular matrix component. Immunoisolation and long-term diabetes reversal were achieved transplanting PEG MG conformally coated islets in a fully MHC-mismatched allotransplantation model in mouse in absence of immunosuppression. Steps toward clinical translation were taken by implementing further refinements to the coating composition and transplant site and by developing a computational model of the transplant site. Engineered fibrin gels used to anchor the islets to the EFP were replaced by a biologic scaffold (autologous plasma of the transplant recipient mixed with recombinant thrombin). The scaffolds were found to perform comparably in vivo in a syngeneic transplant model. Also, Matrigel (not clinically translatable) was replaced with a synthetic polymeric peptide, PepGel. Concerns about dithiothreitol toxicity led to replace it with a 2KDa PEG-dithiol. The materials were first evaluated from a biologic perspective (coating completeness, viability and function in vitro and in vivo in a syngeneic mouse transplantation model) and then adopted as reference material in a computational model of the conformally coated islet in the EFP transplant site. The model allows to study transport phenomena of glucose from the blood vessel to the center of the islet and of insulin in the opposite direction. The total delay between blood glucose increase and insulin release in the bloodstream in the transplantation site could be predicted using the model. The parametric nature of the model also made it possible to compare different capsule compositions. Finally, an application of conformal coating in a context different than diabetes was shown. Human renal epithelial cells were used as a cell model to prove efficacy of conformal coating in potentially endless cell transplantation therapies for regenerative medicine. Overall, the presented work shows great promise for successful translation of the conformal coating technology in clinical applications.

Il trapianto di isole pancreatiche si pone come scopo di ripristinare la presenza di beta-cellule, che vengono distrutte dal sistema immunitario dei pazienti con diabete di tipo 1. Per prevenire il rigetto del trapianto, i pazienti devono sottoporsi a terapia sistemica immunosoppressiva cronica, la quale non e’ completamente efficace e puo’ causare effetti collaterali. Per questo motivo, ad oggi, il trapianto di isole pancreatiche viene effettuato solo nei pazienti piu’ gravi. L’immunoisolamento tramite incapsulamento potrebbe eliminare la necessita’ di trattamento immunosoppressivo, ma il successo clinico della procedura non e’ finora stato raggiunto. Lo scopo di questa tesi di dottorato e’ presentare un nuovo dispositivo per l’incapsulamento conformale di isole con polimeri a base di PEG tramite un sistema fluidodinamico. Il lavoro presentato si propone di superare alcuni dei limiti dell’incapsulamento tradizionale, ed in particolare: i) di ridurre il volume da trapiantare diminuendo lo spessore delle capsule, ii) di incrementare la stabilita’ meccanica delle capsule utilizzando polimeri a base di PEG, iii) di ottimizzare il sito di trapianto di modo da favorire l’attecchimento, iv) di ottimizzare la composizione delle capsule conformali supplementando il PEG con componenti di matrice extracellulare, v) di sviluppare metodi che permettano il controllo e la caratterizzazione veloce di potenziali formulazioni per le capsule grazie e modelli computazionali e tecnologia lab-on-chip, vi) di dimostrare l’applicabilita’ dell’incapsulamento conformale ad approcci di terapia cellulare in ambiti diversi da quello del diabete. Capsule conformali sono state ottenute usando un approccio fluido dinamico: il getto di acqua che si forma tra due fluidi immiscibili (olio e acqua) che fluiscono in maniera coassiale viene rotto tramite l’uso di una geometria a focalizzazione del flusso. Le gocce ottenute sono composte da isole ricoperte da un sottile strato di polimero. Il processo fluidodinamico e’ stato studiato prima in silico tramite un modello computazionale e poi in vitro paragonando diversi prototipi di dispositivo. Le isole sono state incapsulate usando un PEG-divinil-sulfone con l’aggiunta di alginato e reticolato tramite ditiotreitolo (PEG ALG). L’incapsulamento non ha compromesso la vitalita’ e la funzionalita’ delle isole ne’ in vitro ne’ in vivo in un modello di trapianto murino singeneico nella capsula renale (KD). E’ stato poi eseguito uno studio sulla composizione delle capsule e sul sito di trapianto in topi su isole microincapsulate. La sacca epididimale (EFP) si e’ dimostrata un sito di trapianto superiore in termini di riuscita e mantenimento di inversione del diabete a lungo termine. L’aggiunta di PEG all’alginato e la formazione di capsule ibride ha migliorato il tempo di inversione del diabete nella cavita’ intraperitoneale, probabilmente grazie all’innalzamento delle proprieta’ meccaniche delle capsule. Un esito opposto e’ stato ottenuto nel caso dell’EFP, dove problemi di inferiore biocompatibilita’ potrebbero aver causato un tempo di inversione piu’ lungo e un peggiore controllo della glicemia. Le capsule di PEG ALG non sono state in grado di mantenere la normoglicemia a lungo termine in un contesto di allotrapianto in topi. Questo puo’ essere imputato alla struttura macroporosa delle capsule. Per migliorare l’esito dei trapianti, nelle capsule il gruppo divinil-sulfone e’ stato sostituito con il gruppo maleimide, meno reattivo, e come sito di trapianto la capsula renale con la sacca epididimale. L’alginato e’ stato sostituito con il matrigel per fornire alle isole componenti di matrice extracellulare (PEG MG). Le capsule conformali con PEG MG hanno conferito immunoisolamento e hanno reso possibile il mantenimento della normoglicemia a lungo termine in un modello di allotrapianto con completo disaccoppiamento di MHC in assenza di regime immunosoppressivo in topi. I primi passi verso la traslazione clinica sono stati intrapresi rifinendo ulteriormente la composizione delle capsule e del sito di trapianto e sviluppando un modello computazionale del sito di trapianto stesso. I gel di fibrina usati per ancorare le isole alla EFP sono stati sostituiti da uno scaffold biologico (plasma autologo del ricevente il trapianto e trombina ricombinante). Gli scaffold biologici hanno garantito risultati simili ai gel di fibrina in un modello di trapianto singeneico. Inoltre il matrigel, non idoneo per uso clinico, e’ stato sostituito con un peptide polimerico sintetico, pepgel. Dubbi sulla potenziale tossicita’ del ditiotreitolo hanno portato alla sua sostituzione con un PEG-ditiolo lineare di peso molecolare 2KDa. I materiali sono stati inizialmente caratterizzati dal punto di vista biologico (completezza delle capsule, vitalita’ e funzionalita’ delle isole in vitro e in vivo in un modello di trapianto singeneico in topi) e poi adottati come materiale di riferimento per un modello computazionale dell’isola incapsulata conformalmente nel sito di trapianto EFP. Il modello permette di studiare i fenomeni di trasporto del glucosio dal vaso sanguigno al centro dell’isola e dell’insulina nella direzione opposta. Il ritardo totale tra l’incremento nella concentrazione di glucosio nel vaso sanguigno e il rilascio di insulina nella circolazione e’ stato predetto tramite simulazioni in silico. La natura parametrica del modello ha permesso inoltre di mettere a confronto diverse composizioni per le capsule. Infine, e’ stata presentata un’applicazione dell’incapsulamento conformale in un contesto differente da quello del diabete. Cellule renali epiteliali umane sono state usate come esempio per dimostrare l’efficacia dell’incapsulamento conformale in applicazioni potenzialmente infinite della piattaforma di incapsulamento in medicina rigenerativa. In generale, il lavoro presentato dimostra di possedere un grosso potenziale per la traslazione della tecnologia di incapsulamento conformale in applicazioni cliniche.