Dual colour light sheet microscopy in an optofluidic chip

In the last year several new microscopy techniques for biological inspection have been developed. One of these is the Light Sheet Microscopy, and in particular Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM), where the sample is illuminated with a light sheet, obtaining a plane-by-plane optical sectioning, with the main advantage of obtaining threedimensional sample reconstruction at high speed and with low photodamage rate. On the other hand this technique is limited by its time consuming sample mounting and alignment procedure, that could require several minutes each, making it unsuitable for statistical analysis of numerous sample populations. To overcome this limit a first prototype was realized by our research group, consisting in a Lab On Chip device capable to perform automatically SPIM analysis on different samples with no requirement of manual alignment in between. This compact device integrated in a single platform optical and fluidic elements and allowed to process up to 30 specimens per minute. Nevertheless, this device presented some main drowbacks limiting the advantages of this innovative approach, such as an improvable optical resolution, an inefficient sample delivery system, that caused the loss of multiple specimens, and a difficult fluidic control handling due to its multiple inlets channels. This work of thesis is focused on the fabrication and characterization of a new prototype of SPIM On Chip device able to address and to improve these aspects by changing its basic design. Moreover, a central part of this work of thesis dealt with the integration of a double wavelenght fluorescence excitation module on the chip, in order to allow the simultaneous investigation of the sample with two different marker colors. The realization of this challenging integrated device has been possible thanks to the capabilities of Femtosecond Laser Irradiation followed by Chemical Etching (FLICE) technique. This is a very versatile approach, that permits to create three dimensional microfluidic structures in fused silica glass substrates. Moreover the lack of need of masks or clean room environments, facilitated a fast prototype optimization process.

Negli ultimi anni abbiamo assistito a un crescente interesse per lo sviluppo di avanzate tecniche di microscopia per analisi biologica. Una di queste è la Light Sheet Microscopy, e in particolare la Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM), nella quale il campione è illuminato con un foglio di luce che ne eccita localmente la fluorescenza. Questo sezionamento ottico non invasivo, permette di ricostruire immagini tridimensionali del campione in maniera semplice e veloce, riducendo il rischio di fotodanneggiamento. luce, ottenendo un sezionamento ottico piano per piano, con il principale vantaggio di ottenere una ricostruzione tridimensionale del campione velocemente e con un basso tasso di fotodanneggiamento. Questi motivi rendono questa tecnica un potente strumento per l'analisi biologica. Ciò nonostante uno dei principali limiti risiede nelle procedure di montaggio e allineamento del campione, che viene effettuato manualmente e può richiedere parecchi minuti, così da rendere questo approccio particolarmente inadatto per lo studio di un numero statisticamente significativo di campioni. Per superare questi limiti, il nostro gruppo di ricerca ha realizzato un primo prototipo, che consiste in un dispositivo Lab On Chip capace di eseguire automaticamente una analisi SPIM su diversi campioni senza la necessità di un allineamento manuale nel mezzo. Questo dispositivo integra in una sola piattaforma elementi ottici e fluidici e permette di processare fino a 30 campioni al minuto. Tuttavia questo dispositivo presentava alcuni inconvenienti che limitavano i vantaggi di questo approccio innovativo, come ad esempio il margine di miglioramento della risoluzione ottica, e anche del sistema di controllo e manipolazione del campione che causava la perdita di molti elementi all'interno del sistema fluidico, prevendone l'analisi. Inoltre la rete fluidica così come era stata realizzata era di difficile utilizzo, a causa della necessità di controllare simultaneamente i flussi di 4 diversi canali. Proprio in questo ambito si contestualizza il lavoro di questa tesi, volta alla realizzazione di un nuovo prototipo di dispositivo SPIM On Chip, in grado di migliorare questi aspetti, modificando il suo design di base. Inoltre, una parte consistente di questo lavoro affronta l'integrazione nel chip di un modulo per l'eccitazione di fluorescenza con doppia lunghezza d'onda, per permettere l'analisi simultanea di campioni con due diversi colori. La realizzazione di questo dispositivo integrato è stata possibile grazie alle capacità della tecnica di Femtosecond Laser Irradiation followed by Chemical Etching (FLICE). Questo è un approccio dall'estrema versatilità, che permette di creare strutture microfluidiche tridimesionali in un substrato di fused silica. Inoltre, non essendo necessarie maschere litografiche o ambienti di lavoro in clean room, è stato possibile procedere con un processo di ottimizzazione del prototipo con facilità e velocità.